Tswett első kromatogramja

Kromatográfia előnyei a környezeti analízisekben Pontos meghatározás nyomnyi mennyiségekre Mátrixkomponensek zavaró hatása kiküszöbölhető Kicsiny mintaszükséglet Széles lineáris meghatározási koncentráció tartomány Több meghatározás egy analízis során Gyors módszer Jól kapcsolható anyag meghatározási technikákhoz (MS, UV-VIS, IR). Fejlett műszerezettség, automata üzemmód A két anyag egymástól független jelet ad, nagy érzékenység, Csúcsmentes terület. Természetes anyagból több dimenziós, metabolizmus Nagy érzékenység, egy sejtből, bogár potrohából, Anya és metabolitok, homolog sorok, A jelek függetlenek és azonos érzékenységüek 6 sec alat is. MS, NMR, IR, DAD

Nyomnyi mennyiségek meghatározása nagy csúcs mellett, több nagyságrendet átfogva Kis csúcs elsőként elúciója ajánlott, hogy a nagy csúcs farka (tailingje) ne fedje el.

Nyomnyi mennyiségek kimutatása nagymennyiségű mátrixban A többdimenziós, sorba kapcsolt oszlopok használata előnyős a nyomnyi anyagok kimutatásánál. A rendszerben a második oszlopra csak szűk, kivágott frakciót engedtek át.

Egy analízis alatt számos komponens meghatározása megoldható 106 közepesen illékony szennyező anyag GC-MS analízise

Kromatográfia gyors módszer A leghosszabb rutinszerűen használt kromatográfiás analízisek sem tartanak egy óráig. GC Példák

Kromatográfiás folyamat Kromatográfia elválasztási módszer. Kromatográfiában az állófázis és a mozgófázis között megoszlanak az anyagok megoszlanak egyensúlyi állandójuk szerint. A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a beinjektálási ponttól a detektorig jut. Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később eluálódnak mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.

Kromatográfiás elválasztás alapja az eltérő kötödés az állófázishoz. Kis kövek Meder Víz áramlás (mozgó fázis) Nehéz kövek (álló fázis) Kövek a folyóban.

Egy anyag megoszlása két egymással nem elegyedő fázis között Kd = Cm/Cst = p/q E = KdV/(1 +KdV) Where Kd: megoszlási állandó C m: anyag koncentrációja a mozgófázisban Cst : anyag koncentrációja az állófázisban E: extrakciós arány V: fázis arány Két anyagot akkor lehet elválasztani ha megoszlási állandójuk nem egyenlő (Kdx ≠ Kdy).

Egy csúcs megoszlása az állófázis és mozgófázis között A mozgófázis magával ragadja a minta molekuláit. Az állófázisban lévő anyag lemarad a mozgófázisban lévőtől A lassú anyagátadás (anyagátadási ellenállás) miatt.

A csúcsok szélesedése a diffúzió miatt Az anyag kromatográfia során egyre szélesebb tartományt foglal el a diffúzió és az egyenlőtlen V alakú áramlás miatt.

Csúcsok szélesedése az egyenlőtlen áramlás és az anyagátadási ellenállás miatt Okok: zegzugos egyenlőtlen áramlás, lassú diffúzió az üregekből, lassú anyagátadás a fázisok között

Kromatográfia szimulációja

Kromatográfia felosztása mozgófázis szerint Gázkromatográfia, (GC) Folyadékkromatográfia (LC), nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) Szuperkritikus oldószeres kromatográfia (SFC) Elektrokinetikus kromatográfia (EKC) kapilláris elektrokinetikus kromatográfia (CEC)

Kromatográfia felosztása oszlop szerint Töltetes oszlop kromatográfia Kapilláris oszlop kromatográfia Chip kromatográfia Vékonyréteg kromatográfia (TLC) Kromatográfia felosztása kölcsönhatások szerint Megoszlásos kromatográfia Adszorpciós kromatográfia Kizárásos, gél (exclusion) kromatográfia Ioncserés kromatográfia

Kromatográfiában leggyakrabban használt oszlopok jellemzői Tulajdonság Oszloptípus Kapilláris Töltetes Előny Nagy hatékonyság Terhelhetőség Oszlop hossz CE: 0,05 –0,5 m GC: 10- 100 m 0,05 – 0,5 m Rs> 1,5- höz szükséges  1,01-1,03 1,1-1,3 Alkalmazott állóf és mozgófázisok Kevésbé szelektív, gyors (ciklodextrinek) Nagy szelektivitású (cellulózok) Kromatográfiás mód GC, SFC, EKC HPLC, SFC, CEC

Különböző kölcsönhatási erők szerepe egyes kromatográfiás módokban Ideális kromatográfiás Módok egyes anyagokra GC Könnyenilló, hőstabil vegyületek HPLC Poláros, nehezen illó, hőre bomló vegyületek EKC Ionos vegyületek

Kromatográfiás kifejezések Elméleti tányérszám N = 5,54 (tR/wh)2 Kapacitás arány k = tR’/t0 tR: retenciós idő wh: csúcs félérték szélessége A csúcs Gaus görbe alakú

A csúcsok retenciós idővel szélesednek A tányérszám állandó, mivel az nem a mintát hanem a rendszert jellemzi.

Kromatográfiás kifejezések Szelektívitás = tR2’/ tR1’ Felbontás Rs = 1,177 (tR1-tR2)/wh1+wh2) Rs : 1,5 alapvonal felbontás

A szelektivitás függése a hőmérséklettől = tR2’/ tR1’ ln α = Δ(ΔS0)/R- Δ(ΔH0)/RT α: szelektivitás S: entropia H: entalpia R: gáz állandó T: abszolult hőmérséklet

Felbontás függése k, n és  értékétől A mindennapi gyakorlatban fontos szerepet játszik felbontás növelése mellett az analízis idő csökkentése és a túlterhelés elkerülése is. Az ideális kromatográfiás paraméterek kompromisszumok eredménye.

Gázkromatográf (GC) vázlata Gázpalack helyett lehet H2 generátor is.

A hatékonyság függése a vivőgáztól és az áramlási sebességtől A görbe a tányérszám (N) inverzét a tányérmagasság (HETP) értékekeit mutatja, azaz minél kisebb érték, annál jobb a felbontás.

Split/splitless injekror Beinjektáláskor a minta elpárolog a forró injektorban. A felesleget a split szelepen lefúvatjuk, hogy elkerüljük a túlterhelés és a hosszan elnyúló oldószercsúcsot.

Töltetes és kapilláris oszlopok összehasonlítása GCben A kapillárisok kisebb áramlási ellenállása miatt sokkal hosszabb oszlopokat használatát teszi lehetővé, ami nagyobb hatékonyságot és ezért jobb felbontást biztosít.

GC-s kapilláris keresztmetszete Általános paraméterek Hossz, 5-50 m Átmérő: 0,1-0,5 mm Filmvastagság: 0,1-5 µm Oszlop anyaga: kvarc Állófázis: hőstabil szilikon vagy PEG polimer Ma már jóformán csak kapilláris oszlopot használnak GCben.

Kolonnatér (kemence) Ahhoz, hogy egy anyag haladjon az oszlopon legalább 15 Hgmm parciális nyomással kell rendelkeznie. Az anyagok parciális nyomása megnövelhető hőmérséklet emeléssel. A kolonna térnek pontosan szabályozott egyenletes hőmérsékletűnek kell lenni. temperature temperature Izoterm Hőmérséklet program

Oszlophossz hatása Hosszabb oszlopon jobb a felbontás, de időigényesebbek az analízisek.

Szelektivitás változtatása az állófázissal

Túlterhelés hatása

Különböző detektorok érzékenysége

Detektorok áttekintése

Elválasztás függése a szelektivitástól és a hatékonyságtól HPLC hatékonysága mérsékelt (<100 000N) , de szelektív).

Nagyhatékonyságú kromatográf (HPLC) vázlata A gázmentesítés (degasser) fontos, hogy a pumpa folyadékot tudjon felszívni, és csökkenjen az alapvonal zaj (noise).

Pumpa Pump head Motor & Cam Check valves Plunger Plunger seal

Forgócsapos (rotary valve) injektálás HPLCben A hurok (loop) pontos mennyiségű, áramlás megzavarása nélküli beinjektálást biztosít.

Oldószerek (mozgófázisok) polaritási sora

Elúciós gradiens előnye HPLCben A gradiens gyorsabb analíziseket és érzékenyebb detektálást biztosít.

Normál/Fordított fázis Állófázis Mozgó fázis Normál Magas polsarítású (hidrofil) Alacsony polaritású (hidrofób) Fordított Magas polaritású A fordított fázist használják leggyakrabban.

Minta polarítás - retenciós idő fordított fázison C18 (ODS) OH weak strong CH3

Oldószererősség hatása fordított (C18) HPLCs állófázison Az oldószererősség (mozgó fázis) csökkenésével nő a retenció, kapacitásarány és a felbontás.

Borított szilika szemcse szerkezete

A leggyakrabban használt C18 HPLCs állófázis szerkezete Apoláris anyagoknak nagyobb a retenciója. Mozgófázis poláris oldószer (víz, metanol, acetonitril).

Normál fázisú, adsorptiós kromatográfia Az állófázisnak csak a felszíne lép kölcsönhatásba

Ioncserés kromatográfia elve Az állófázis ionjai visszatartják az ellentétes töltésű ionokat. Az erősebb ionoknak ( Cl- > CO32-) nagyobb a retenciója.

Gélkromatográfia (méretkizárásos, size exclusion), alapja A nagy molekulák mivel nem férnek be a kis csatornákba kisebb kölcsönhatással bírnak, ezért hamarabb elúálódnak.

Karbamát rovarölő szerek HPLC-UV analízise speciálisan kifejlesztett állófázison Az anyagok hőbomlásuk miatt nem alkalmasak GCs elemzésekre

Különböző detektorokkal elérhető kimutatási határ, és szelektivitásuk jellemzése Electrokémiai Sz Tömeg spektrométer U Fluoreszcens Sz Ultraibolya Sz Törésmutató U Fényszórás U Sz, szelektív; U, univerzális

Diodasoros (DAD) UV-VIS detektor vázlata

Definíciók Az elektroforézisnél az oszlop (réteg) két végére elektródokon keresztül feszültség van kapcsolva. Az oldatban lévő ionok a feszültség hatására elmozdulnak az ellentétes pólusú elektród felé. Az ionok töltésüktől és „méretüktől” függő sebességgel mozognak (migrálnak). Az elektroforézis alapjaiban nem kromatográfia, mert nincs megoszlás két fázis között. A minőségi jellemző a migrációs idő (tm) Mennyiségi jellemző a csúcsterület (A)

Kapilláriselektroforézis készülék diagramja Oszlop: kvarc, 15-70 cm x 0,02-0,075 mm.

Kapilláris előnyei az elektroforézisben Nagy hőleadás → nagyfeszültségesés → gyors analízisek → nagy hatékonyság U alakú áramlásprofil On-column detektálás Kevés puffer és minta szükséglet Csekély mintaelőkésztés igény az analízisek közötti gyors, hatékony oszlop regenerálás (0,1 N NaOH) miatt Egyszerű kezelés

A töltéssel elrendeződés és a zeta potenciál kvarc kapillárisnál A kvarc kapilláris felületén lévő szilanol negatív töltéssel rendelkeznek pH 3 fölött.

Az EOF áramlás profilja Az EOF áramlásprofilja laposabb mint a laminárisé, ezért a minta keskenyebb tartományba oszlik el, azaz nagyobb a hatékonysága.

A tényleges és a látszólagos mozgékonyság

A különböző kapilláris elektroforézises módszerek Zonális Elektroforézis Izoelektromos fókuszálás Izotahoforézis.

A különböző kapilláris elektroforézises módszerek Zonális elektroforézis: A különböző anyagok eltérő sebességgel haladnak töltésük és méretük szerint. Izoelektromos fokuszálás: A kapillárison pH gradiens van. Az ampholitok (pozitív és negatív töltéssel is rendelkezetnek) az izoelektromos (semleges) pontjuknak megfelelő helyen koncetrálódnak, és nem vándorolnak tovább. Kapilláris izotachoforézis: A vizsgált anyagok vezető és záró elektrolit között foglanak helyet vezetőképességűk sorrendjében, és egyforma sebességgel haladnak.

Micelláris elektrokinetikus kromatográfia

A MEKC alapja

Detektorok UV-VIS Fluorescens Tömegspektrométer Konduktometriás

Chipek, mint kromatográfiás oszlopok EKC Mars szondán használt kromatográf

Elektroozmotikus áramlás (EOF) szerepe a kapilláris elektrokromatográfiában (CEC)

CEC alkalmazása 16 EPA PAH analízisiére

Gradiens CEC-ben