Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium kv1n1lv1 Bemutatkozás

Folyadékkromatográfiás állófázisokról ALAK-FORMA IRREGULÁRIS – TÖRMELÉK SZEMCSÉK (POROK) GÖMBSZIMMETRIKUS – SZFEROID SZEMCSÉK SZEMCSEMÉRET >1 m ELOSZLÁS - HATÁROK GAUSSI, vagy ASZIMMETRIKUS ELOSZLÁS, HOMODISZPERZ - HETERO(POLI)-DISZPERZ SZERKEZET HOMOGÉN (TÖMÖR) SZEMCSÉK ADHÉZIÓVAL, vagy KÉMIAILAG KÖTÖTT FELÜLETI RÉTEGEK PORÓZUS (PELLICULÁRIS) FELÜLETI RÉTEGEK TÁGPÓRUSÚ (PORÓZUS, PERFUZÍV) TÖLTETEK TÖMBPOLIMER (MONOLIT) OSZLOPOK … HALMAZ ÁLLAPOT SZILÁRD (rigid, xerogél) – GÉL (liogél) – FOLYADÉK STABILITÁS NYOMÁS, HŐ, pH, OLDÉKONYSÁG, BAKTERIÁLIS, KÉMIAI

OH Si O H OH Si O A szilikagél felülete Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8) Határfelületen nem disszociált szilanol csoportok OH Si O Szilárd fázis Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”) OH Si O Izolált szilanol csoportok Vicinális szilanol csoportok H Dezaktivált szilanol csoportok

Fémszennyezések hatása

Módosított szilika állófázisok Si CH3 O CH2 NH2 Árnyékoló Távtartó Kölcsönható CN NO2 CH(OH)-CH2(OH) C18 …..

Módosított szilika állófázisok NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP) - OH (diol) - C2, -C4, -C8, -C18 - CN (ciano) - C6H5 (fenil) - NO2 (nitro) - etil, - NH2 (amino) - i-propil - N(CH3)2 (dimetil amino) - i-butil

Módosított szilika állófázisok

Módosított szilika állófázisok Classic ODS Conventional (non-endcapped) Sterically Protected (non-endcapped) Conventional (endcapped) * Savasan hidrolizálhat

Normál fázisú folyadékkromatográfia

Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis Mikor alkalmazzuk? Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására; Hexán oldható vegyületek; Helyzeti izomerek elválasztására. Állófázisok Szilikagél (40-50%); Alumínium-oxid (3-10%); Királis állófázis (20-25%); Módosított szilikagél (pl. NH2, CN, NO2, diol stb.).

Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Mozgófázisok (eluens) Apolárisabb az állófázisnál Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel Detektor kompatibilitás Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O2 mentes stb.) Alacsony viszkozitású ( < 1 cP 25C-on) Könnyen beszerezhető, elfogadható áron Biztonságos (CCl4 benzol stb. egészségre káros) Könnyen keveredő Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt)

Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP) RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer (elválasztások 80%-a); Állófázisok Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 28); Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 114); Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%)

Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok Eluenserősség Elúciós erő Víz< Metanol<Acetonitril<Etanol<Izopropanol<Tetrahidrofurán Szelektivitás

A pH szerepe az RP-HPLC-ben Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH k pKa Robusztus Robusztus !!! K’ Nem robusztus !!! pH=2 !!! pH=8 pKa-2 pKa+2

A pH szerepe az RP-HPLC-ben Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Pufferekkel szemben támasztott követelmények: A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz; Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!); Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése; Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb); A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben; Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel);

Ismétlés vége

Izokratikus ill. gradiens elúció tR (min) mAU GRADIENS tR (min) mAU

Izokratikus ill. gradiens elúció Az eluens erősség változása F B C D E B+C D+E 30% ACN 70% 20mM Foszfát, pH=6.95 50% ACN 50% 20mM 80% ACN 20% 20mM A: Feniletilamin B: Piridin C: 2-Picolin D: 2,4 Lutidin E: 4-ethylpiridin F: 2,3 dimetilanilin Az eluens erősség változása

Gradiens elúció

Pumpa, injektor, mixer, kapillárisok…. Gradiens elúció Pumpa, injektor, mixer, kapillárisok….

Gradiens elúció Gradiens elúció problémák: Egyensúly beállás idő; Mozgófázis tisztasága („0” –lépésként oldószer ellenőrzése); Retenciós sorrend (szelektivitás) változása; Oldószer probléma (k>10 vs. a minta oldása); Detektor kompatibilitás (pl. RI detektor).

Gradiens elúció – nyomás profil Viszkozitás – összetétel összefüggés Kísérleti körülmények: Purosphere C18, 5mm; 125*3mm, 25C 0,56ml/perc 1 ml/perc 75% AcN 100% AcN 0,56ml/perc

HPLC pumpák fajtái Discontinuous Pumps Continuous Pumps Syringe Pumps Gas driven displacement pump Membrane Pumps Piston Pumps

Fecskendő típus (Syringe pumpa); Áramlás <20µL/min (általában 1 - 2 µL/min) MS detektor Fecskendő pumpa Előnye: Pulzálás mentes; Egyszerű szerkezet; Hátránya: Újrafeltöltést igényel;

Pneumatikus erősítésű (Haskel –típus); Pumpa Pneumatikus erősítésű (Haskel –típus); levegő levegő eluens eluens szelep szelep

Diaphragm Pumps

Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák. Pumpa Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák.

Dual Piston Parallel Pump Check Valves Rotary Switching Valve Pumphead Piston A B Single Combined Piston Delivery Delivery Piston 'A' Advancing Piston B Retracting

Dual Piston Pump in Series

Ballvalves for Reciprocating Piston Pumps

Oldószer kompresszibilitás kérdése!!! Pumpa Alternáló mozgást végző, dugattyús pumpák. Előnye: Folyamatos, megbízható működés; Egyszerű szerkezet; Hátránya: Pulzálás; Csoportosítás: Alacsony nyomású; Magas nyomású keverést megvalósító pumpa. Oldószer kompresszibilitás kérdése!!! Pulzálás csillapító flexibilis membrán és Kompresszálható folyadék

Gradient Formation Low Pressure Gradient High Pressure Gradient

Eluensszállító rendszer

Performance Parameters for HPLC pumps: Flow Precision Flow Range Pump summary The pump is the most critical piece of equipment for a successfully operating HPLC. Performance Parameters for HPLC pumps: Flow Precision Flow Range Delay Volume Pressure Pulse Composition Precision

MIP-Molecularly Imprinted Polimer Célvegyület Célvegyület Monomerek Elrendeződés Polimerizáció (UV vagy T) Célvegyület Extrakció MIP - célvegyület

MIP-Molecularly Imprinted Polimer MIP-alkalmazás

Affinitás kromatográfia

Affinitás kromatográfia Alkalmazások: Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk; Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására; Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az ellenanyagot termelte; Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből (hemoperfúzió); Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban. Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek ipari méretekben történő gyártására.

Affinitás kromatográfia Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer. ligandum távtartó + + + + + + + +

+ Gél Gél CO-CH2 IgG-NH2 OCH2CONH(CH2)2NHCO(CH2)2COO-N CO-CH2 távtartó Affinitás kromatográfia CO-CH2 + Gél IgG-NH2 OCH2CONH(CH2)2NHCO(CH2)2COO-N CO-CH2 távtartó NH-IgG Gél Immunoadszorbens Kapcsolások hatékonysága 60-75%; Oszlop kapacitása 8-12 mg IgG/ml gél.

Affinitás kromatográfia 1. Kondicionálás Puffer

Affinitás kromatográfia 2. Mintafelvitel és mosás Puffer

Affinitás kromatográfia 2. Eluálás Eluáló szer

Affinitás kromatográfia egyensúly Minta megkötődése, egyéb komponensek eluálása Minta eluálása egyensúly Abszorbancia mAU váltás elúciós pufferre mintafelvitel 1-2 ot. x ot. 1-2 ot. >1 ot. 1-2 ot. Oszlop térfogat (ot)

Affinitás kromatográfia Immobilizált fém affinitás kromatográfia (immobilized metal affinity chromatography - IMAC) Immobilizáljuk a fémet kelát képző ligandumok segítségével; Különböző stabilitású komplexek képződnek a fém és olyan proteinek között, amelyek elektron donor csoportot tartalmaznak (pl hisztidin, triptofán, cisztein vagy foszfát csoport). A komplex stabilitása függ a ligandum, fém típusától, elektron donor csoport sztérikus hozzáférhetőségétől, hőmérséklettől, pH és kompetitív donor jelenlététől. Alkalmazott pH=6-8. Eluálás pH gradienssel vagy a glicin, hisztidin, hisztamin, cisztein koncentrációjának növelésével (N és/vagy S tartalmú vegyületek, amelyek erős elektron donorként leszorítják a proteint a fémről).

A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE

102-108 Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztása Gélkromatográfia 102-108 Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztása Alkalmazások: Polimerek, polimer adalékok vizsgálata; Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása; Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás; Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból); A minta sómentesítése; Puffer csere.

Nincs kölcsönhatás a minta-molekula és az állófázis között!! Gélkromatográfia Gél szemcse Pórusok (dp> 100A) Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta-molekula és az állófázis között!! Eltérő méretű molekulákból álló minta

Eltérő méretű molekulákból álló minta Gélkromatográfia „Fordított szita” Abs 265nm Idő (perc) Eltérő méretű molekulákból álló minta

Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány Gélkromatográfia Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans); Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány Teljes kizárási tartomány lgM V (ml)

Sómentesítés gélkromatográfiával Gélkromatográfia Sómentesítés gélkromatográfiával

Antitest tisztaságvizsgálata gélkromatográfiával Gélkromatográfia Antitest tisztaságvizsgálata gélkromatográfiával

MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL Gélkromatográfia MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE Gélkromatográfia A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.