Molekuláris genetikai-genomikai módszerek Falus András

Egy populáción belüli genetikailag meghatározott különbség POLIMORFIZMUS Egy populáción belüli genetikailag meghatározott különbség

Genomvariációk Gyakori szekvencia Variációk Polimorfizmus Deléció Inszerció Kromoszóma Transzlokáció

Variációs típusok Nagyméretű: Kromoszóma számbeli Kromoszóma átrendeződések, kromoszómaszegment duplikációk, és deléciók Közepes: Szekvencia ismétlődések (repeatek) Transzpozonok Kis deléciók, szekvenciális és tandem repeatek (mikroszatelliták) Kicsi: Single Nucleotide Polymorphisms (SNP-k) Egyetlen bázis érintő inszerciók és deléciók (indelek)

SNP

Mi az SNP (Single Nucleotide Polymorphism)? Ugyanahhoz a fajhoz tartozó két egyed között egyetlen bázis eltérése ugyanabban a DNS pozícióban, gyakoriság >1 % . ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT ATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGT   snp snp Az SNP-k replikációs hiba vagy DNS károsodás révén jönnek létre.

Az SNP-k típusai Génben lévő, kódoló SNP-k Nem-szinoním szinoním Fenntartja vagy megváltoztatja a fehérje szerkezetét/funkcióját szinoním Fenntartja vagy megváltoztatja a splicing-ot Génben lévő, nem-kódoló SNP-k Szabályozó/Regulációs SNP-k Fenntartja vagy megváltoztatja a génexpressziót Intronban lévő SNP-k Fenntartja vagy megváltoztatja a génexpressziót/splicing-ot Kapcsolt SNP-k (túlnyomó számú) Rendszerint gének közöttiek (intergenikusak)

Az SNP-k megváltoztathatják vagy változatlanul hagyhatják a fehérje szerkezetét DNS SNP C-ről G-re mRNS RNS kodon CUC-ról CUG-re Fehérje leucinról leucinra Leucin Leucin Nincs változás a fehérje szerkezetében

SNP térképek Sok ember genomjának szekvenálása A bázissorrendek összehasonlítása az SNP-k felderítése céljából Egy olyan humán genomtérkép elkészítése, ami az összes SNP-t tartalmazza = ez az SNP térkép Emberi genomban ~10.000.000 SNP (1/300)

SNP térképek Az összes szekvenált kromoszóma SNP pozíció Az összes regisztrált SNP

SNP Profil/Mintázat Minden egyes ember genomja egy sajátos SNP mintázatot hordoz. Az emberek SNP profiljuk/mintázatuk alapján csoportosíthatók. Az SNP profilok fontosak a gyógyszeres terápiában a válaszkészség meghatározásában. Kapcsolat lehet bizonyos SNP profilok és egy bizonyos kezelésre adott meghatározott válaszreakciók között.

Az összes egyed genotipizálása sok ezer SNP-re Betegség iránt fogékony populáció Az összes egyed genotipizálása sok ezer SNP-re ATGATTATAG ATGTTTATAG Az összes rezisztens személynek A van az X gén 4-es pozíciójában, míg minden fogékonynak T van ugyanabban a pozícióban génX Rezisztens populáció

SNP Profilok

AZ SNP-k felhasználása Génazonosítás és –térképezés Diagnosztika/kockázat becslés A válaszreakció megbecslése Homogenitás vizsgálat/kísérlet tervezés A gén funkciójának azonosítása

Az SNP adatok felhasználása Evolúciós vizsgálatok Különböző polpulációk evolúciós történetének felderítésére „DNS ujjlenyomat”készítés Apasági vizsgálatok, bűnügyek Markerként használhatók poligénes jellegek térképezése során Genotípus specifikus gyógykezelés A legtöbb gén SNP-ket tartalmaz A gének 93%-ának egynél több SNP-je van 39%-uk 10-nél több SNP-t tartalmaz!

Van-e összefüggés a marker megléte és a betegség között? Betegségre hajlamos Kontroll Betegségre nem fogékony Allél 1 Allél 2 Az A marker összefüggést mutat a fenotípussal A Marker : Allél 1 = Allél 2 =

Következtetés korábbi adatokból és megfigyelésekből SNP: single nucleotide polymorphism Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 5 Patient 6 Patient 7 Patient 8 Patient 9 Patient 10 Patient 11 Patient 12 Good response ATGCTTCCCTTTTAAA ATTGTTCCCTTTTAAA ATTGTTGCCTTTTAAA ATGGTTGCCTTTTAAA ATAGTTGCCTTTTAAT ATGATTGCCTTTTAAA ATGATTGGCTTTTAAA ATGTTTCGCTTTTAAA ATGTTTTGCTTTTAAA ATTTTTTGCTTTTAAA ATCTTTTGCTTTTAAA No response Good response Good response Good response Good response Good response Good response 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Következtetés előre; ki fog jól válaszolni a gyógyszerre? GCCCGCCTC GCCCACCTC From McLeod and Evans, Ann Rev of Pharmacol and Toxicol, 2001: 41,101-121

A farmakogenomika nagy igérete "Pharmacogenomics will radically change the manner in which we develop drugs." "Soon, we will be able to get the right drug into the right patient." "Applying pharmacogenomics to drug development will cut cycle times to 1.5 - 2 years." "Pharmacogenomics will be able to bring removed drugs back on the market, by predicting who is susceptible to adverse events." Közel vagyunk???

REPEATS

TRINUKLEOTID (TRIPLET) REPEAT BETEGSÉGEK A trinukeotid repeatek nagyon gyakori szekvenciák - a legtöbb nem kapcsolódik betegséggel - sok közülük polimorf (változik a repeatek száma) Két fő típusuk van - Nem-kódoló eltérő mechanizmusúak - Kódoló poliglutamin polialanin

Poliglutamin Polialanin betegségek Neurodegeneratív betegségek Különböző fehérjék Funkciónyerés Változó hosszúság Expanzió Replikációs csúszás CAG vagy CTG repeat Fejlődési rendellenességek Transzkripciós faktorok Funkcióvesztés +/- Konstans hossz Állandó Egyenlőtlen crossing over GCA, GCT, GCG, GCC repeatek - nem teljesek

(huntingtin) (Huntingtin) a/ feltüntetett repeatszámok a normális tartományra jellemző értékek; b/ zárójelben az érintett fehérjék neve szerepel (huntingtin) = kódoló szakaszban = nem kódoló szakaszban (Huntingtin)

Collaborative Research MATLEKLMKAFESLKSFQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQPPPP PPPPPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPPPPPPPPPPGPAVAEEPLHRPK KELSATKKDRVNHCLTICENIVAQSVRNSPEFQKLLGIAHELFLLCSDD... HUNTINGTIN 350 kD fehérje 10-11 kb transzkriptum mindenütt expresszálódik ismeretlen funkció összefüggés a repeat-szám és a betegség kezdete között Huntington’s Disease Collaborative Research Group 1993 nyomán

PCR

Q-PCR

MICROARRAY -CHIP

Összehasonlító hibridizáció Két különböző biológiai forrás (pl. beteg/egészséges)

Prepare Fluorescently to identify patterns of gene expression Microarray Overview Measure Fluorescence in 2 channels red/green Prepare Fluorescently Labeled Probes Control Test Hybridize, Wash Analyze the data to identify patterns of gene expression

Diffúz nagysejtes B sejt lymphoma Eddig nem volt diff. diagnózisa: Szövettani Immunológiai PCR (egyes gének) módszerrel

A melanoma máj metastasis prediktor génkészlete Előre jelezni melyik melanomás betegnek lesz májáttétje??

Prediktor gének kiválasztása A mikroarray orvosi gyakorlatban való felhasználásának elvi háttere Az egyes betegek mintáiból készült mikroarray-k Az adatok számítógépes csoportosítása Gének ( 10 2 - 103) Minták (X-tengely) Prediktor gének kiválasztása Diagnózis, megelőzés, terápia meghatározása A betegségre nézve szelektív mikroarray fejlesztése

SINGLE-BASE EXTENSION

5’ Tag SNP primer SNP site 3’ 5’ PCR target Primer Extention Labeled terminating NTP 3’ 5’ Denature & Hybridize Substrate (spot on plate) SNP Primer Tag complement for Hybridization capture

http://www.dgci.sote.hu/microarray http://www.dgci.sote.hu/snpcore