3. szekció Szaporítóanyag termelés és minőség 7. Szaporodásbiológiai Találkozó, 2000. november 7. EGER 3. szekció Szaporítóanyag termelés és minőség Moderátor: Dr. Gábor György tudományos főmunkatárs, ÁTK, Herceghalom

Elvárások a szaporítóanyagokkal szemben Sperma és embrió: genetikailag értékes legyen dr. Zsilinszky László ne jelentsen egészségügyi veszélyt, kockázatot dr. Henk Wentink, dr.Török Imre jó termékenyülési eredménnyel lehessen használni dr. Drén Csaba, dr. Zsilinszky László, dr. Szász Ferenc és dr.Török Imre, dr. Gábor György - dr. Cseh Sándor

A felhasználói igények kielégítése a szaporítóanyag termelésben Dr. Gábor György1 tudományos főmunkatárs, Dr. Cseh Sándor2 egyetemi docens 1ÁTK, Herceghalom, SZIE ÁOTK2

Sperma felhasználás a világban 1998-ban 11.6 millió adag friss, hígított, és 232.3 millió adag mélyhűtött szarvasmarha spermát (kis része bivaly) állítottak elő világszerte, és kb. 106.6 millió első termékenyítést végeztek el. (Thibier, 2000). Ugyanez juh esetében 6.7 millió adag friss, és 435 ezer adag mélyhűtött spermát jelentett, amikkel összesen kb. 3.2 millió első termékenyítést végeztek. Kecske esetében: 318 ezer friss, 385 ezer mélyhűtött adag, 468 ezer első termékenyítés. Sertés: 65 millió adag friss és 16 ezer adag mélyhűtött sperma, 40.3 millió első termékenyítés. (Wagner, 2000)

Előrejelezhető-e a fertilitás (sperma)? Mindenki törekszik jó minőségű szaporítóanyagok előállítására, és forgalmazására - de a mai napig nincs olyan biztos előrejelzési módszer, ami pontosan előrejelezné a fertilitást. Egy NAAB (1986) áttekintés a sperma laboratóriumi teszteléséről, megállapítja azt, hogy a módszerek pontosságának igazolása a legfontosabb, és ezt a tenyészetekben a vemhesülési arány követésével lehet a legjobban ellenőrizni: Mikroszkópos morfológiai vizsgálat - szubjektív, az eltérő vizsgálati módszerek miatt nagy különbségek vannak a laborok között és változó kutatási eredményeket közöltek a fertilitással való összefüggéséről. Mikroszkópos vizuális motilitás vizsgálat - nagyon szubjektív, erősen minta függő, alacsony az ismételhetősége laboron belül és laborok között is, alacsony korreláció a fertilitással. Elektronikus motilitás vizsgálat (HTM) - nem ajánlja a magas ár és a gyenge ismételhetőség miatt. Sperma sűrűség: alacsony az ismételhetősége a laborok között, néhány módszernél túl nagy a variabilitás, limitált korreláció a fertilitással. Egyéb módszerek (nyák penetráció, hörcsög pete penetráció): limitált használati lehetőség és korreláció a fertilitással.

Újabb lehetőségek CASA (computer assisted semen analysis - nincs vizuális információ, ÁR!!) IVOS (Hamilton-Thorn - motilitás és morfológia - ÁR!!) Transmigration (Holzmann, 1998 - bonyolult, idő, ár) SQA (Alpharma - olcsó, de nincs vizuális információ, csak friss spermára van kidolgozva) FireZyme 2000 luminometer (Biomedica Diagnostics, ATP tartalom vizsgálatán alapszik - tesztelés alatt) komplex (Swim-up, ZBA, IVF, Rodriguez-Martinez, 1998 ) CASPAR (Gábor és mtsai, 1999) Testicular echotexture (ET, Gábor és mtsai 1996-99)

Embrió felhasználás a világban IETS News Letters, 1993

Az embriók minőségének (életképességének) ellenőrzése Több módszert lehet használni, de a gyakorlatban csak és kizárólag a morfológiai bélyegek alapján való bírálatot használják. A többi eljárás, mint pl. anyagcsere folyamatok tesztelése (glükóz fogyasztás), festés, stb. nem gyakorlatias, kivitelezésük üzemi körülmények között komoly nehézségeket okozna, ezért nem alkalmazzák őket.

Az embriók minőségének ellenőrzése morfológiai bélyegek alapján az embrió alakja (szférikussága), színe, a sejtek (blasztomerek) alakja, színe, esetleges méretbeli különbségek (egyforma méretűek legyenek), korának megfelelő fejlettségi stádiumban kell lennie (pl. morula – 6.5 napos, blasztociszta – 7-8 napos), a belső állományból kilökődött blasztomerek száma, aránya az egész embrióhoz képest.

Az embriók nemzetközi kereskedelme IETS (Nemzetközi Embrió Átültető Szövetség) felügyeli. Illetékes bizottságai dolgozzák ki azokat a direktivákat, amelyek arra hivatottak, hogy a nemzetközi kereskedelemben csak olyan embriók “vegyenek részt”, amelyeket azonos módon készitettek elő. 1) az embriót speciális enzimet tartalmazó oldattal kell kezelni fagyasztás előtt (megtisztitják a zona pellucidát), hogy a fertőző betegségek továbbvitelét megakadályozzák, 2) igyekeznek egységesiteni a különböző mélyhűtési protokollokat, 3) adatszolgáltatási kötelezettség (az embriót kötelező jelleggel kisérik azok az adatlapok, amelyek az embrió származásával, a donorok állategészségügyi helyzetével /egyedi és környezet igazolás/, az alkalmazott mélyhűtési eljárással kapcsolatban minden szükséges információt tartalmaznak. Javaslatot kell tenni a felolvasztási eljárásra is.

Bika sperma export-import Dr. Török Imre ügyvezető igazgató Génbank Kft., Mezőhegyes

Behozatal szabályozása 1993 évi CXIV. törvény az állattenyésztésről 41.§ tenyészállat illetve szaporítóanyag behozatala, kivitele · Minisztérium előzetes szakmai hozzájárulása - Állategészségügyi hozzájárulás · Külön jogszabályok (VPOP) · Tenyésztő szervezet véleményezése - Tenyészértékbecslés módja megfelelő - Tenyészértéke (vagy több gazdaságilag lényeges tulajdonsága felülmúlja a hazai tenyészérték átlagát) - Ismert származás, hivatalos nyilvántartás - Hazai törzskönyvelési feltételek biztosítottak - Hazai tenyészállományt pótol – elismert fajtáknál - Rendelkezik vércsoport vizsgálati eredménnyel, utódai származásellenőrzéséhez, - Szaporítóanyag: fizikai és biológiai minőségi tulajdonságai a behozatali előírásoknak megfelelnek. Kivitel feltételei · Hiteles származási igazolás (tenyészállat + szaporítóanyag) · Szaporítóanyagnál: minőségigazolás (OMMI vizsgálat) · Állami támogatásban részesült tenyészállományok egyedei és a szaporítóanyag kiviteléhez FVM engedély kell · A fogadó ország által előírt állategészségügyi vizsgálatok kedvező eredményei.

Behozatal 34/1994 (VI.28.) FM (módosított) rendelet a Tv. meghatározásán túl: · Tenyészállat esetén az FVM előzetes szakmai hozzájárulási kérelemhez csatolni kell: Megyei Állategészségügyi és Élelmiszer Ellenőrző Állomás igazolását: - a kérelmező tenyészete állategészségügyi szempontból alkalmas a fogadásra - megfelelő karantén lehetőség biztosított · A Minisztérium a szakmai hozzájárulást megküldi a kérelmezőnek, OMMI-nak, aki azokról nyilvántartást vezet · A Minisztérium szakmai hozzájárulása csak a tenyészállat vagy szaporítóanyag beléptetésére, továbbítására és raktározására jogosít. · Az OMMI a szakmai hozzájárulásnak megfelelő behozatalról igazolást állít ki, ha: - a szaporítóanyag rendelkezik származásigazolással - a szaporítóanyagot adó tenyészállat rendelkezik vérkártyával - rendelkezik központi lajstromszámmal - a szaporítóanyag fizikai, biológiai és minőségi tulajdonságai az előírásoknak megfelelnek. Ezen igazolás alapján minősül a mélyhűtött sperma szaporítóanyagnak és kezdeményezhető a belföldi forgalom számára való vámkezelése.

A behozott szaporítóanyag karanténozás alatti vizsgálatai: · A határállomáson történő beléptetési vámeljárás után a bontatlan, lezárt konténert az OMMI karantén depójába kell szállítani. · A szállító konténer zárja csak az OMMI karanténban bontható fel. · A konténertérkép alapján minden ejakulátumból mintavételt végez az OMMI szakembere. OMMI vizsgálat OÁI vizsgálat Felolvasztás után -legalább 8 millió élő spermium Kórokozó baktériumfajok -legalább 35% élénk előrehaladó egyenes vonalú mozgás (23-25 millióból) Kórokozó mycoplazma fajok -rendellenes spermium 20 % alatt -akroszóma sérülés 10 % alatt Kórokozó gombafajok -élő aerob baktérium 200 000/cm3 alatt

Tenyészbika (jelölt) beállítása A célpárosításból született bikaborjú a tenyészet telepén, Felvásárlás előtt MTÁ-ra beszállítás: (5-9 hónapos korban) · ENAR azonosító · Karanténozás 30 nap; · Származás azonosítás, vércsoportvizsgálat, vérkártya · vizsgálatok: · Leptospirózis szerológiai vizsgálat mint korábban + Trichomonadozis (tasaköblítő) vizsgálat + Kampilobakteriózis (tasaköblítő) vizsgálat · Brucellózis szerológiai vizsgálat + Tuberculin bőrpróba · Leukózis szerológiai vizsgálat tulajdonosváltozás bejelentése = marhalevél · IBR szerológiai vizsgálat · Kromoszóma vizsgálat · Paratuberkulózis szerológiai vizsgálat · BLAD · BVD vírusizoláció · Kappa kazein · Béta laktoglobulin · Származási lap Termelésbe állítás: 10 hónapos – 12 hónapos · Központi lajstromszám Natív spermavizsgálat OMMI labor által: - bakteriológia, - gombavizsgálat, - morfológiai vizsgálat, - fagyasztási próba (MTÁ), · Sperma mélyhűtés megkezdése Mélyhűtött sperma minta (ejaculatumonként) vizsgálata OMMI által. - felolvasztás utáni élő spermiumok – előrehaladó mozgást végzők aránya. - baktériumos, gombás fertőzöttség.

Mesterséges Termékenyítő Állomás Beérkező állatok karanténozása, vizsgálatok Félévenkénti rendszeres vizsgálatok minden bikára (ugyanaz, mint a karanténban) A termelt spermákból termelési szám szerinti vizsgálat szúrópróba-szerűen OMMI laborban Minden ejaculatum; friss sperma helybeni vizsgálata: Érzékszervi vizsgálat: - mennyiség, - szín, - idegen alkotórészek. Műszeres vizsgálat: - sűrűség (spekrofotométer), - spermiumszám (számított), - hígíthatóság, - morfológiai vizsgálat, - mozgás: motilitás / intenzitás Mélyhűtés: - visszaolvasztás, - vizsgálat: spermiumszám, - motilitás,

Műszalma jelölésminták

HOLSTEIN-FRÍZ SPERMAFORGALOM ÖSSZETÉTELE (1997-1999)

Minőségi bikasperma előállítás hazai gyakorlata Dr. Szász Ferenc vezérigazgató OMT RT Gödöllő

A mesterséges termékenyítés jelentősége Olyan biotechnikai eljárás, amely nélkül a genetikai előrehaladás nem képzelhető el. Nem megfelelő döntés ill. technikai hiba esetén óriási kártétel keletkezhet - egy ejakulátumból, ui. akár 1000 termékenyítő adag is készülhet. Ez egy kisebb tehenészet éves szükségletével egyenlő, és rossz minőség esetén a gazdaság jövedelmezőségét teheti tönkre.

Hogyan lehet sperma minőséget garantálni előre? A mesterséges termékenyítés bevezetése óta a törekvés egy olyan objektív spermabírálati rendszer alkalmazása, ami a fogamzási eredmények pontos prognosztizálhatóságát garantálja. A mai napig nincs olyan módszer, ami a fogamzás eredményét előre garantáltan meg lehet jósolni. A termelt szaporítóanyag „fertlitására” biztos támpontot egyedül a termelési szám alapján elvégzett termékenyítések eredményeiből számított, a fertilitásra utaló NRR (non-return-rate) vagy a korábban kötelezően elvégzett vemhességi vizsgálat adhat.

Hogyan lehet előre lépni? 1. Bikák andrológiai szűrése Az Országos Mesterséges Részvénytársaságnál folyamatosan próbálkozunk olyan eljárásokat bevezetni, alkalmazni, amelyek segítségével a fiatal felvásárolt bika borjaknak a fertilitást negatívan befolyásoló örökletes és szerzett andrológiai abnormitásait kívánjuk feltérni, és az érintett egyedeket a spermatermelésből kizárni. Ezt a komplex andrológiai vizsgálatot a spermatermelés megkezdése előtt 6 hónappal végezzük el először, majd pedig a spermatermelés kezdete után 1-3 hónappal megismételjük. Valamennyi bika andrológiai adata egy adatbázisba kerül, ami a későbbiekben a tenyésztők segítségére lehet az esetleges célpárosítások előkészítésében is.

Milyen vizsgálatokat végzünk? Hereborék-körméret Here forma Here konzisztencia Elsősorban morfológiai jellegű vizsgálatok Here ultrahangos szerkezete (testicular echotexture) Normál calcificatio orchitis fibrosis

Hogyan lehet előre lépni? 2. A termelt sperma minőségének javítása A bikák monodietikus takarmányának beltartalmát folyamatos ellenőrizzük kiegészítés zöld takarmánnyal, télen sárgarépával A spermatermelési technológiánkat az elmúlt évben egyeztettük a Holland Genetics laboratóriumával, és laboratóriumi dolgozóinkat Hollandiába küldtük tanulmányútra. Az ejakulátum szokásos makroszkópikus és mikroszkópikus vizsgálata után a koncentrációt meghatározzuk, majd Triladyl médiummal a szükséges mértékben hígítunk, és ezt követően számítógép vezérelte automata fagyasztóban mélyhűtünk. A fagyasztás után 28 nappal újabb mikroszkópikus (vizuális, szubjektív) bírálatot végzünk az expedíció előtt minden minden ejakulátumból, és ezt követően állítjuk csak ki a minőségi bizonyítványt. Ennek a vizsgálatnak a biztonságát a jövőben tovább kívánjuk növelni, ezért a vizuális vizsgálat mellett a számítógépes (objektív) analizálást és a sperma morfológiai vizsgálatát is bevezettük.

Mi lehet a megoldás? Korrekt adatgyűjtés Naprakész adatbázisok létrehozása Adatbázisok összekapcsolása

TesTracto software (developed for the data base) was used for the evaluation of the ultrasonic ET

New development of the software: distribution evaluation of the gray levels