Mikrobiológia labor Segédanyag a közös mikroszkópos gyakorlatokhoz Összeállították: Dr. Janzsó Béla Dr. Molnár Mónika Nagy Zsuzsanna Dr. Suhajda Ágnes Tolner Mária 2013. március Módosításokkal lezárva: 2017. szeptember

Mikroszkóp képalkotása 1. B: preparátum c’ : az objektív által alkotott, fordított állású nagyított valódi kép c : az okulár által c’-ről alkotott nagyított virtuális kép Mikroszkóp nagyítása: objektív x okulár

A mikroszkóp felbontóképessége d = az a legkisebb távolság a tárgyon, amelynek végpontjait a mikroszkópos képen még különállónak látjuk Abbe → d = λ / sinµ ill. λ / n ·sinµ ahol λ: a megvilágító fény hullámhossza, µ: a beeső fény-nyaláb félkúpszöge n: a preparátum és az objektív közötti közeg törésmutatója n · sinµ = A (NA) az objektív numerikus aperturája levegő → n = 1 immerziós olajok → n = 1,3 -1,6 Olajimmerzió használata csak speciális objektívvel!

A mikroszkóp felbontóképessége (folyt.) Az optikai tengellyel párhuzamos megvilágítás esetén: d= λ / n ·sinµ = λ / A Ferde megvilágítás esetén: d= λ / 2 ·n ·sinµ = λ / 2A ↑

Az élőlények öt országa

Mikroorganizmus definíciója Egysejtű, vagy olyan többsejtű szervezetek, amelyeknél még nincsen szöveti differenciálódás az egyes sejtcsoportok között. Egysejtű lehet prokarióta (baktériumok) vagy eukarióta (élesztőgombák) szervezet. Egysejtű és többsejtű mikroba szervezetek között átmeneti formák is léteznek , amelyeknél még nincsen az egyes sejtek között határozott sejtfal (cönocita szervezet). Egy sejtfallal körbezárt citoplazma tömeg, benne több maggal. Bizonyos moszatoknál és gombáknál fordul elő. Többsejtű: fonalas, telepes vagy lemezes - de nem szövetes.

Többsejtű mikroba szervezetek telepes fonalas lemezes

Élesztőgombák Saccharomyces cerevisiae (sütő- vagy pékélesztő) Sejtjei oválisak, 5–10 m átmérőjűek, sarjadzással, más néven bimbózással szaporodik.

Élesztőgombák Schizosaccharomyces pombe Sejtjei lekerekedett végű henger alakúak. Hasadással szaporodik. Átmérője kb. 3,5 m, hossza pedig kb. 8-14 m. A sarjadzó élesztővel (S. cerevisiae) ellentétben a Schizosacch. pombe osztódása szimmetrikus: két (közel!) azonos méretű leánysejt keletkezik.

Penészgombák Mucor sp. (fejespenész) Mucor racemosus spóratartó fejek (sporangia) spórákkal Mucor mucedo tenyészet

Penészgombák Rhizopus sp. Rhizopus stolonifer spóratartó fej Rhizopus nigricans tenyészet kenyéren „lépegető penész”

Penészgombák Aspergillus sp. Aspergillus niger (feketepenész vagy korompenész)  konídiumtartóról lesodródott konídiumok konídiumtartó térhatású felvételen 

Penészgombák Penicillium sp. Penicillium expansum  ecsetszerű konídiumtartók és lesodródott konídiumok konídiumtartó térhatású felvételen  Penicillium sp. tenyészet Petri-csészében

Baktérium sejtformák

Baktériumok mozgásszervei (falgellumok) A monotrich B lofotrich C amfitrich D peritrich

Endospórás baktériumok példa:

Sugárgombák (fonalas baktériumok) Actinobacteria (Actinomycetes)

Sugárgombák fejlődési ciklusa

Baktériumok Lactobacillus plantarum Mikroszkópos felvétel festett preparátumról Scanning elektronmikroszkópos felvétel

Baktériumok Lactococcus (Streptoccocus) lactis Scanning elektronmikroszkópos felvétel Mikroszkópos felvétel Gram színezett tenyészetről (Gram+ baktérium)

Baktériumok Escherichia coli Fakultatív anaerob, pálcika alakú baktérium. Általában peritrich csillós, de lehet csillótlan is. Könnyen és jól tenyészthető. Rendszerint melegvérű állatok tápcsatornájának alsó szakaszában él. A legtöbb szerotípus ártalmatlan, de vannak emberben ételmérgezést okozó változatai is. Fekális eredetű szennyezés indikátora. A veszélytelen törzsek az emésztőrendszer normális flórájához tartoznak, K2-vitamint termelnek. Jelenlétük megnehezíti egyes patogének elszaporodását a bélrendszerben. Gram festés szerint negatív

Baktériumok Pseudomonas fluorescens Nagyon változatos metabolizmussal rendelkező, talajban, természetes vizekben gyakran előforduló, ún. ubikviter baktérium. Obligát aerob, pálcika alakú, többszörös flagellummal rendelkezik. Tenyészete UV fényben zöldeskék színben fluoreszkál. Gram szerint (az E. coli -hoz hasonlóan) negatív festődésű.

Baktériumok Bacillus subtilis Szénabacilus néven is ismert, a talajban, növényeken általánosan fellelhető Gram+, baktérium. Pálcika formájú, aerob, endospórás. Sok ostora van, ezért gyors mozgásra képes. Bacillus endospórák spóraszínezéssel Scanning elektronmikroszkópos felvétel

Baktériumok Streptomyces sp. (fonalas baktériumok) Streptomyces coelicolor tenyészete Petri-csészében  Streptomyces rimosus

Streptomyces platensis fonalas sejtek és a fonalak végéről lefűződő és szabaddá vált spórák

Speciális és összetett színezési módszerek Mikroorganizmusok minőségi vizsgálata Többféle színezék alkalmazása Célok Mikroorganizmusok differenciálása Speciális sejtalkotórészek kimutatása

Mitokondrium kimutatása Glikogén kimutatása Spóraszínezés Gram-színezés Tok kimutatása Mitokondrium kimutatása Glikogén kimutatása Spóraszínezés http://biologia.laguia2000.com/citologia/partes-de-la-celula-procariota http://cassany.cat/ESO/celula/eucariota.jpg

Baktériumok sejtfaltípusai Szervezet Sejthatároló felület összetétele Speciális jellemzők Mollicutes (pl. Mycoplasma sp.), L-forma, szferoplaszt, protoplaszt (pl. Bacillus megaterium), Archea (Thermoplasma, Ferroplasma) Citoplazma-membrán Nincs sejtfal Gram-pozitív baktériumok Sejtfal (egyrétegű), citoplazma-membrán Vastag peptidoglikán (murein) réteg, Mg-ribonukleát Gram-negatív baktériumok Sejtfal (többrétegű), citoplazma-membrán Vékony peptidoglikán réteg, lipoproteinek, külső membrán, lipopoliszacharidok Archea (pl. Halobacterium sp.) S-réteg (fehérjék), citoplazma-membrán Nincs peptidoglikán (kiv. metanogének pszeudopeptidoglikánja) Mycobacterium sp. Lipidek és viasz, citoplazma-membrán Nincs peptidoglikán Lampropedia hyalina Külső kettős köpeny, cementálóréteg, sejtfal, citoplazma-membrán ?

Különleges sejtfalak Halobacterium, Owens Lake, California http://green-enb150.blogspot.hu/2011/03/extremophiles-animals.html http://ytpo.net/viruses/virus.php?id=1408&name =Mycoplasma%20hominis&limit=1400 Halobacterium, Owens Lake, California Mycoplasma hominis Lampropedia hyalina (Blu Nilo festék) http://eboals.bologna.enea.it/ambtd/articoli/lamprope.htm

A peptidoglikán https://www3.nd.edu/~aseriann/CHAP11B.html/img037.gif

Gram- és Gram+ sejtfal felépítése http://www.microbiologyinfo.com/differences-between-gram-positive-and-gram-negative-bacteria/

Gram-színezés Hans Christian Joachim Gram (dán kutató) Elv: trifenil-metán típusú színezék + jód oldat jódpararozanilin komplex Gram+ sejtekből nem mosható ki, Gram- sejtekből igen + kontraszt színezés Eredmény Japán Gram-próba (40 % KOH) http://www.path.cam.ac.uk/Microbiology/BI_Bacteriology/CL_Clostridia/M_BI_CL_20small.jpg http://faculty.ccbcmd.edu/courses/bio141/labmanua/lab6/images/Ecoli01_scale.jpg http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Gramposcocci.jpg

Tok kimutatása Tok: nyálkaburok, körülveszi a sejtet Anyaga: homogén vagy heterogén, poliszacharid, polipeptid, aminocukor, fehérje-lipopoliszacharid Egyszerű vagy bordás Szerepe: patogének virulenciája, véd a fagocitózis ellen véd a kiszáradástól tartalék tápanyag lokalizáció tápanyag-adszorpció Kimutatás: negatív festés

Mitokondrium és glikogén kimutatása Mitokondrium : kémiai energia átalakítása és termelése Kimutatása: Redox festékkel (mitokondriumban oxidált állapotban marad) Glikogén: tartaléktápanyag, glükóz poliszacharid, gyorsan mobilizálható tápanyag Lugollal

Endospóraképzés Bacillus, Clostridium, Sporosarcina sp. A szülősejt kitartó állapota, nincs anyagcseréje A túlélést teszi lehetővé Rendkívül ellenálló Elhelyezkedés: terminális, centrális, szubterminális, Alak: szubtilisz (1,2), klosztrídium (3,4,5,6) http://w3.georgikon.hu/tanszekek/Novtud/Mikrobiologia/agr%20mikro%201.pdf

Az endospóra szerkezete

Módszerek lépésről lépésre

Gram-festés menete Bacillus cereus Gram (+) Escherichia coli Gram (–) Kenet készítés Szárítás Rögzítés Festés kristályibolyával 2 percig /leönteni!/ Lugol 2 perc Mosás aceton-etanollal Mosás csapvízzel Festés szafraninnal 2-3 perc Mikroszkópizálás (40x) Olajimmerzió Gram (+) sejt kék Gram (–) sejt piros

Speciális sejtalkotórészek kimutatása Tok, mitokondrium, glikogén Tokfestés Schizosaccharomyces pombe  Egy csepp tusban szuszpendálunk egy kacsnyi 72 órás mikrobát.   Mitokondrium festés Saccharomyces cerevisiae (T22)  Egy csepp Janus zöld oldatban szuszpendálunk 1 kacsnyi 24 órás T22-t. Glikogén festés Egy csepp Lugol oldatban szuszpendálunk 1 kacsnyi 24 órás T22-t.

Spóraszínezés Karbolfuxinnal Malachitzölddel Szuszpenzió készítése Szárítás Rögzítés /láng felett 2-3szor áthúzni/ 10 percig szárítópadkán Ziehl-Nielsen féle karbolfuxinnal melegítjük /ne száradjon be/ Vizes öblítés 10%-os kénsavval mosás Festés metilénkékkel 2-3 perc Mosás csapvízzel Mikroszkópizálás (40x) Malachitzölddel Szuszpenzió készítése Szárítás Rögzítés /láng felett áthúzni 2-3 szor / 10 percig szárítópadkán malachitzölddel melegítjük /ne száradjon be/ Mosás 1/2 percig vízzel Szafraninos festés 3 perc Mosás csapvízzel Mikroszkópizálás (40x) Spóra: zöld Vegetatív sejt: piros Spóra: piros Vegetatív sejt: kék

Mérés mikroszkóppal Okulár mikrométer Objektív mikrométer (a mikroszkóp szemlencséjébe kell beilleszteni) Objektív mikrométerrel kalibrálandó 100 osztást tartalmaz Objektív mikrométer mérőskálát tartalmazó, csiszolt tárgylemez, amelyen 1 osztás 10 m 1 mm = 100 rész (0,01 mm = 1 rész)

Okulár mikrométer kalibrálása Az okulár mikrométeren egy 5 vagy 10 mm hosszú vonalszakasz 100 részre van osztva. Ezt a mérőokulárba helyezzük. Az objektív mikrométer egy csiszolt tárgylemez, amelyen egy 1 mm-es vonalszakasz 100 részre van osztva és fedőlemezzel le van fedve. Mikroszkópos méréshez meg kell állapítani az okulár mikrométer 1 osztásközének az értékét. Ehhez az objektív mikrométert a tárgyasztalra helyezzük, az objektív mikrométer osztásait élesre állítjuk. A látótérben most a két mikrométer-osztást egyszerre látjuk. A tárgyasztal mozgatásával és az okulár elfordításával a két mikrométer-osztást fedésbe hozzuk úgy, hogy a két kezdőpont egybeessen. Megkeressük a két skálán azt a pontot, ahol a két osztásvonal egybeesik. Megszámoljuk az objektív- és az okulár mikrométer osztásvonalainak számát eddig a pontig. Az okulár mikrométer 1 osztásközének értéke μm-ben: (objektív mikrométer-osztások száma × 10) / (okulár mikrométer-osztások száma). Különböző nagyításoknál különböző értékeket kapunk. Dr. Horváth Sándor: Mikrobiológiai praktikum, Tankönyvkiadó, Budapest, 1980

Az okulár mikrométer kalibrálása után mérhetünk a mikroszkóppal sejtek méretét (átmérő, hossz, vastagság), szálas anyagok vastagságát, mikroszkópikus részecskék méreteit stb.

Mikroszkópos számlálókamra: Bürker Élesztők és penészgomba konídiumok, spórák számlálására A számlálókamrák különlegesen kiképzett tárgylemezek, amelyeken ismert területű beosztás található. A fedőlemez feltételével meghatározott magasságú réteg keletkezik és ezáltal a beosztásban elhelyezkedő folyadék térfogata ismert. A Bürker kamra két négyzethálós beosztású teret tartalmaz. Kamra mélysége: 0,1 mm X: 1/400 mm2 Y: 1/25 mm2

Számlálás Bürker kamrában A Bürker-kamra két egymástól vájattal elválasztott négyzetes beosztást tartalmaz, így akár két különböző szuszpenzió vizsgálatára alkalmas. A megszámlálandó négyzeteket a számlálókamra egész felületéről véletlenszerűen választjuk ki. A számlálásnál célszerű következetesen a felső és a jobb oldali határvonalon levő sejteket a négyzet belsejében levőkhöz adni. Az 1 ml-ben lévő sejtszámot úgy számítjuk ki, hogy a kis négyzetekhez tartozó átlagos sejtszámot 4×106-nal, a nagy négyzetekhez tartozót 2,5×105-nel szorozzuk.