A microarray Comperativ Genom Hybridizálás (aCGH) technika prenatális alkalmazásának lehetőségei a magzati rendellenességek kimutatásában   Tidrenczel Zsolt¹, Karcagi Veronika² , Pikó Henrietta², Tóth András¹, Tardy Erika¹, Demeter János¹, Beke Artúr³   ¹Magyar Honvédség Egészségügyi Központ, Szülészet- Nőgyógyászati Osztály, Genetikai Centrum, Budapest ²OKI, Molekuláris genetikai Laboratórium ³SE, I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika

A prenatális szűrés és diagnosztika alapja Ultrahang vizsgálat Anyai vérből végzett szűrő módszerek: biokémiai tesztek (PAPP-A, βHCG, inhibin, AFP, ösztriol) Új generációs szekvenálás (NIPT) Invazív diagnosztika - GAC - CVS kromoszóma vizsgálat - magzati szövet

A diagnosztika gold standardja: A kromoszóma vizsgálat- karyotipizálás Alkalmas a magzati kromoszómák számbeli és durva szerkezeti rendellenességeinek kimutatására Felbontási határa: Klasszikus G- sávozással a DNS 5-10 Mb (5-10 millió bázis) nagysága High resolution sávozással 3-5 Mb nagysága FISH (fluoreszcens in situ hybridizálás) kb. 3 Mb

5 Mb alatti DNS eltérések A DNS hiányával vagy többletével járó kórképek- mikrodeléciós/ duplikációs szindrómák: Legalább 80 ilyen kórkép ismert, pl: DiGeorge sy- 22q11.2 deléció. 1:2000-1:4000. Szív, thymus, arc, száj, szájpad Prader-Willi/Angelmann sy- 15q11-13 deléció/UPD. 1: 10000. Hypotónia, arc, koponya,mentális retardáció. William sy- 7q11 deléció. 1:8000-1:10000. Izomrendszer, kötőszövet, hypótonia, arc, szív. Smith- Magenis sy- 17p11.2 deléció. 1:25000. Szív, gerinc, arc, mentális reardáció. Cri-du-chat sy- 5p deléció. 1:30000. Szív, arc, koponya, mentális retardáció. Wolf- Hirschhorn sy- 4p deléció. Arc, koponya, mentális retardáció. TAR sy- 1q21.1 deléció. Radius, trombocytopénia, szív, vese, ujjak Langer- Giedion sy- 8q23-24 deléció, Arc, koponya, mentális retardáció, kéz, csont. Rubinstein- Taybi sy- 16p13.3 deléció. Arc, koponya, kéz- láb, mentális retardáció. Miller- Dieker sy- 17p13.3 deléció. Arc, koponya, agy, vese WAGR sy- 11p13 deléció. Vese, genitália, szem, mentális retardáció 1p36 deléciós sy, 9q34 deléciós sy…

DNS hiánnyal/ többlettel járó kórképek = CNV- copy number variations- a DNS kópia szám eltérései Súlyos multiplex kórképek (mentális retardáció, arc, koponya, szív, neurológia, szervi eltérések) Szülői életkortól függetlenek Előfordulási gyakoriságuk 1:2000-4000 (??) Gyakran járnak prenatális Uh eltéréssel (arc, koponya, szív, tarkó, végtag, vese..) Évente Magyarországon kb. 50-100 ilyen gyermek születhet (??) DE: Prevalence of recurrent pathogenic microdeletions and microduplications in over 9500 pregnancies, Grati et al., Prenatal Diagnosis, 2015, 35, 801- 809 A patogén mikrodeléciók és duplikációk aránya különböző okból invazív mintavételre kerülő populációban kb. 0.7% 1:143

Molekuláris citogenetikai vizsgálatok FISH- fluoreszcens in situ hybridizálás Célzott vizsgálat esetén fluoreszcensen jelölt DNS próbával az adott kromoszóma(részlet) vizsgálatára Microarray Comperativ Genom Hibridizálás (aCGH)- molekuláris genotipizálás Teljes kromoszómaszerelvény vizsgálatára alkalmas nagy felbontásban. Számbeli és szerkezeti DNS elváltozások vizsgálatára. Különböző fluoreszcens festékkel jelölt vizsgálati minták összehasonlító vizsgálata Szilárd fázisra (chipre) hibridizálva, számítógépes értékeléssel. Gyors (nem szükséges tenyésztés), automatizált, megbízható, nagy pontosságú módszer. Alkalmas: aneuploidiák (triszomiák), polyploidia, mozaikosság (20% kimutatására), kiegyensúlyozatlan transzlokációk vizsgálatára is.

Application of Array-Based Comparative Genomic Hybridization to Clinical Diagnostics, Bassem A., Bejjam and Lisa Sheffer, J of Molecular Diagnostics, Nov. 2006

Alkalmazott array CGH technika: Alkalmazott array CGH technika: Agilent 4 x 180 K SurePrint G3 CGH+SNP prenatal 120 000 CGH próba; 60 000 SNP próba (5-10 Mb LOH) 164 eddig leírt citogenetikai szindróma detektálása és több ezer gén együttes vizsgálata

Microarray analízis lépései Minta Referencia Microarray analízis lépései Szilárd hordozó, amelynek felületét nagyszámú próbák fedik A próba lehet: DNS, cDNS (oligonukleotidok; DNS fragmentumok) RNS Fehérje A minta (beteg) DNS és a referencia DNS jelölése különböző fluoreszcens festékkel (Cy3/minta DNS és Cy5/referencia DNS) A próbákkal az adott ismert géneket valamint nem-kódoló szakaszokat jelölhetnek. A minta DNS és a referencia DNS fluoreszcens jel intenzitását összehasonlítva kapjuk meg az eredményt: sárga: jelet azonosítunk a két (minta és referencia jel) azonos intenzitású piros jel: a referencia fluoreszcens jelintenzitása nagyobb (deléció) zöld jel: a minta fluoreszcens jelintenzitása nagyobb (duplikáció)

Virtuális kariogram

aCGH-al nyerhető többlet genetikai információ a hagyományos karyotipizáláshoz képest- nemzetközi adatok Szerző Év Újság Többlet genetikai információ (patogén CNV) Tyreman et al. 2009 J Med Genet 10.4% Van der Veyver at al. Prenat. Diagn. 5% Faas et al. 2010 J Med Genet. 6.7% Hillmann et al. 2011 Ultrasound Obstet Gynecol 5.2% D’Amours et al. 2012 Clin Genet 12.2% Srebniak et al. Mol Cytogenet 8% Evangeildou et al. 2013 Biomed Res. Int. 13.3% Rooryck et al. Eur J Med Genet 11.3%

Array CGH DNS kópia szám eltérései nem függenek össze az anyai életkorral! – életkori határt nem érdemes figyelembe venni Elsődlegesen strukturális ultrahang eltérést (nem minor jelek!!) mutató magzatoknál lehet indikált Az aCGH kb. 7-8%-ban igazol szignifikáns patogén DNS eltérést olyan magzatoknál, ahol a hagyományos karyotipizálás eltérést nem mutatott és az ultrahang vizsgálat során eltérés volt látható, míg az átlag populációban ez kb. 1%. ( The clinical utility of microarray technologies applied to prenatal cytogenetics in the presence of a normal conventional karyotype: a review of the literature Jonathan L. A. Callaway, Lisa G. Shaffer, Lyn S. Chitty, Jill A. Rosenfeld and John A. Crolla Prenat Diagn 2013,33,1119-1123)

Detection rates of clinically significant genomic alterations by microarray analysis for specific anomalies detected by ultrasound Lisa G. Shaffer, Jill A. Rosenfeld, Mindy P. Dabell, Justine Coppinger, Anne M. Bandholz, JayW. Ellison, J. Britt Ravnan, Beth S. Torchia, Blake C. Ballif and Allan J. Fisher Prenatal Diagnosis, 2012, 32, 986-995 Izolált strukturális anomália (UH) Detektált CNV Vaskos NF, NT 10.3% Hydrops, ödéma 7% Posterior fossa 6.8% Hypoplasias bal szívfél 9.5% Cerebellum hypoplasia 16.7% Ajak/szájpad hasadék 9.1% Holoprosencephalia 15.1% Dongaláb 13.6% Cystikus vese 6.7% Poly/syndactilia Diaphragma hernia 8.3% Esophagus atresia 33.3%

Nemzetközi protokollok Egyesült Államok: The American College of Obstetricians and Gynecologists Comittee on Genetics Society for Maternal-Fetal Medicine: elsődlegesen az ultrahang rendellenességet mutató magzatok esetén a microarray CGH a rutin prenatális vizsgálatok része legyen, akár a klasszikus karyotipizálást helyettesítő módszerként. /ACOG Comittee Opinion, December 2013, Number 581/ UK: jelenleg is prospektív multicentrikus kutatások zajlanak (EACH- Evaluation of Array Comperative Genomic Hybridisation in prenatal diagnosis of fetal anomalies) Európa: Hollandia, Dánia: egyetemi centrumokban végzik. Németország, Franciaország: nincs szabályozás.

A kutatási tervünk Megvizsgáljuk a centrumainkban genetikai tanácsadáson megjelent és invazív beavatkozásra kerülő várandósok körében az aCGH prenatális használatának lehetőségeit Kidolgozzuk a vizsgálatok pontos protokollját Vizsgáljuk a mikrodeléciós/ duplikációs kórképek, CNV-k gyakoriságát Az észlelt eltérésekre adatbázist hozzunk létre Javaslatot tegyünk arra vonatkozóan, hogy mely esetekben lehetne indokolt a hagyományos karyotipizálást molekuláris citogenetikai vizsgálattal (aCGH) kiegészíteni

Szülői transzlokáció hordozás CVS Array CGH Életkor 37 év felett Genetikai tanácsadás Szülői transzlokáció hordozás CVS Array CGH Neg. Pozitív . (UH eltérés) CVS Array CGH Pozitív (magas kockázat) CVS, GAC Pozitív (UH eltérés) CVS, GAC Array CGH Genetikai tanácsadás Neg. Terhesség tovább viselése Terhesség terminálása 11-13 heti I. UH szűrés Kombinált szűrés NIPT 18-20 heti II. UH szűrés

Array CGH indikációs köre Életkortól függetlenül azon terhesek, akiknél a következő UH eltérések esetén negatív karyotipust igazolunk: NT> 3mm, cysticus hygroma, nyaki cysta, ajak- szájpad hasadék, arc és intracraniális eltérések (posterior fossa, cerebellum), microcephalia Korai IUGR, hydrops Végtag, ujj deformitás Vitium (VSD, Fallot- tetralógia, Bal szívfél hypoplasia) Omphalocele, diaphragma hernia, komplex urogenitális eltérések

genetikai tanácsadás, invazív beavatkozás (CVS,GAC) Vizsgálati protokoll genetikai tanácsadás, invazív beavatkozás (CVS,GAC) Karyotipizálás pozitív negatív tanácsadás array CGH terminálás pozitív negatív szülők vizsgálata tanácsadás konfirmálás célzott FISH próbával, fPCR tovább viselés tanácsadás, terminálás Pozitív UH lelet

Invazív mintavételek a Honvéd Kórházban 2009-2015 417

MH EK Genetikai Centrum 2014 391 mintavétel (163 CVS, 228 GAC) Strukturális UH eltérés miatt: 24 mintavétel, ebből 7 igazolt kromoszóma rendellenesség 2015 január- június 250 mintavétel (125 CVS, 125 GAC) Strukturális UH eltérés miatt: 20 mintavétel, ebből 3 igazolt kromoszóma rendellenesség

Összefoglalás A microarray CGH egy nagy felbontású molekuláris citogenetikai vizsgálat, mely a DNS kis méretű eltéréseinek vizsgálatára alkalmas Invazív beavatkozásra kerülő terhesek esetén a vizsgálat lepényi és magzatvíz mintából is elvégezhető Elsődleges indikációs kör a hagyományos karyotipizálással negatív, strukturális UH eltérést mutató magzatok Az esetek 7-8%-ban addicionális információt ad, patogén DNS eltérést igazol Eredménye gyors, megbízható (kb. 48h) Használata szóba jön ismeretlen eredetű méhen belüli elhalás és habituális abortus esetén is (erre is tervezünk vizsgálatot)

Összefoglalás Hátrányai: Költséges módszer (kb. 120 E Ft) Anyai vérből nem végezhető, invazív mintavétel szükséges 20 %-nál kisebb mozaicizmus detektálására, kiegyensúlyozott transzlokációk, pontmutációk vizsgálatára nem alkalmas a módszer Az értékelés nehézségei: a kapott DNS eltérés mennyire bizonyíthatóan patogén?? (uncertain clinical significance result) jogi vonatkozások!!!, genetikai tanácsadás szerepe!!! Az új generációs szekvenáló eljárások (NIPT, stb..) mikor vehetik át a szerepét (költség, felbontás, hatékonyság, megbízhatóság) ???

Köszönöm megtisztelő figyelmüket