Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben."— Előadás másolata:

1 Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben

2 mrna.html

3 Újra a vektorokról A baktérium expressziós vektorok néhány tulajdonsága: Indukálható promóter rendszer; Ki-be kapcsolás Fehérje fúziós tag; Tisztítás, oldhatóság

4 Általános tanácsok prikarióta génexpresszióhoz 1. Intront ne felejtse el kivágni 2. Ellenőrizze az inzert orientációját 3. Fúzió frame-ben legyen Leggyakoribb hibák: 4. Nincs poszttranszlációs modifikáció = nem biztos, hogy aktív a termék

5 mrna.html Intronok Nem probléma, ha cDNS-t klónozunk

6 Az inzert orientációja: alkalmazzon inkompatibilis ragadós végeket pfdg/ teaching/genes.htm

7 Fúziós fehérjék. Ha fúziós fehérjét kíván expresszáltatni, akkor győződjön meg arról, hogy mindkettő ugyanabban a leolvasási keretben van-e pfdg/ teaching/genes.htm

8 Poszttranszlációs modifikáció Golgi van az eukarióta sejtekben, a prokariótákban nincs nucleus Golgi

9 Trans-Golgi Network RER = Rough endoplasmic reticulum perth.uwlax.edu/faculty/howard/ PROTEINTRANSPORTPROTEINTRANSPORT

10 Cis -GolgiMedial -Golgi Cis –Golgi Medial -Golgi glikozilezés – E. coli-ban mindez nincs

11 Az expresszió hatékonysága E. coli-ban Függ a: 1. Promóter és terminátor típusa 2. mRNS affinitása a riboszómához 3. A transzgén kópiaszáma és helyzete (kromoszóma, vagy plazmid) 4. A fehérje végtermék lokalizációja a sejtben 5. A transzláció hatékonysága a gazdában 6. A fehérje termék stabilitása a gazdában Génről génre optimalizálni kell a rendszert Nincs egységes stratégia

12 A transzkripciót befolyásoló tényezők 1.Promóterek (szabályozhatók is) Prokarióta!! 2. Terminátorok Prokarióta!!

13 Baktérium promóter Pribnow box Promoter search Open promoter complex

14 A prokarióta promóterek közötti különbség kicsi, de fontos lehet 411

15 UP elem erősebbé teheti a promótert (RNS polimeráz kötődés) UP element Core promoter FIS sites UP element

16 FIS protein = DNS kötődés és hajlítás (binding and bending) FIS helyek a baktérium promótereknél növelik az expressziót

17 Eukarióta promóterek csak első pillantásra hasonlítanak a prokarióta promóterekhez Minden szekvencia más, euk. promóterek nem működnek E. coli-ban

18 Prokarióta terminátorok hasznosak

19 Egy jó transzkripciós terminátor erősen javítja a transzláció hatékonyságát Korlátozza az átírást, plazmid replikáció, stabilitás!

20 A transzlációt befolyásoló tényezők 1. Riboszóma kötő hely (RBS) 2. Kodon használat 3. mRNS stabilitás

21 Riboszóma-kötőhely (Ribosome binding site (RBS)) = <10 nt A gén 5’ végén a hajtű kerülendő (GC tartalom minimális legyen) A második kodon vizsgálata; Jó ha AAA – lizin (13.9% az E.coli géneknek). 15x-ös növekedés.

22 kodon preferencia Gln (Q)CAA97.0 CAG3.0 Leu (L)TTA55.5 CTC9.7 CTA4.7 CTG0.7 tRNS ellátottság a gazdában. Néhány gént teljesen újra kell szintetizálni.

23 Kodon használat: E. coli ↔ ember

24 Kodon optimalizálás Új gén kémiai szintézis Másik gazda Módosított gazda tRNS-ek termeltetése

25 human HG expressziója Dictyostelium-ban (eukarióta példa, de E. coli-ban is hasonló problémák) human chorionic gonadotropin Dictyostelium –ban (AT >75%) Kodon használat %. 4-5x-ös növekedés. Érdekesség: csak az első as volt fontos (5’-specifikus hatás, riboszóma megáll és leesik). További optimalizálásnak gyakorlati jelentősége nem volt.

26 Kereskedelmi E. coli törzsek ritka kodon génekkel BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (AT-rich compatible) arginine (AGG, AGA), isoleucine (AUA) and leucine (CUA) BL21 (DE3) CodonPlus-RP (GC-rich compatible) arginine (AGG, AGA) and proline (CCC) (AT-rich compatible) Rosetta or Rosetta (DE3) AGG/AGA (arginine), CGG (arginine), AUA (isoleucine) CUA (leucine)CCC (proline), and GGA (glycine)

27 RNS transzkriptum stabilitás Prokariótákban a legtöbb mRNS kis félélet-idejű Növelni, több idő a transzlációhoz Az 5’ és a 3’ szekvenciák befolyásolják az RNáz érzékenységet Kevés az információ

28 Fehérje stabilitás 1.Proteáz aktivitás a sejtben 2. N-terminális aminosav szekvencia 3. Belső szekvencia motívumok növelik a proteolízis lehetőségét P prolin E glutaminsav S szerin T treonin …. PEST aminosavak mutációja….

29 Proteáz hiányos gazda BL21, E. coli expresszió, lon (citoplazma) ompT (periplazma). Nem lehet mindet, mert proteázok kellenek a metabolizmushoz.

30 N-terminális aminosavak hatása béta- galaktozidáz fehérje stabilitására + az N-terminálishoz ½ élet-idő Met, Ser, Ala> 20 óra Thr, Val, Gly> 20 óra Ily, Glu> 30 perc Tyr, Gln~10 perc Pro7 perc Phe, Leu, Asp, Lys3 perc Arg2 perc (gyilkos)

31 PEST szekvencia a humán CFTR fehérjében (cystic fibrosis) P prolin E glutaminsav S szerin T treonin

32 Idukálható baktérium promóterek Miért nem konstitutív, nagyon erős promóter? indukció A rekombináns (idegen) fehérje gyakran toxikus. A baktériumok a káros plazmidokat igyekeznek elveszíteni. A szaporodáshoz idő kell

33 BL(DE3) indukálható rendszer és a pET vektorok (Novagen) 1)T7 RNS polimeráz gén kromoszómába integráltatva a lac promóter és operátor szabályozása alatt 2) Laktóz analóg, IPTG, gazda termeli a T7 RNS polimerázt  3) Az E. coli gazda genomban ott a lacI (represszor) gén pET23 yfg expressziója az erős promoterről 4) Megbízható, pontos szabályozás, stabil gazda, szaporítás és termelés külön fázis

34 T7 polimeráz CRP cAMP CRP CAP = catabolite gene activator protein = CRP

35 pETBlue: a lacZ gén a másik szálon Kék-fehér screening

36 A lac rendszer alap expressziója már elég (leaky promóter, szivárog), hogy a gazda ne, vagy csak nagyon rosszul növekedjen inducer nélkül is A legtöbb transzmembrán fehérje toxikus az E. coli-ra

37 Hogyan előzhető meg a szivárgás? lacI q és lacI sq – mutáns E.coli törzsek “quantity” és “superquantity” represszor; Rengeteg represszor, de indukálható A célfehérje mennyisége a sejtekben IPTG

38 ARABINÓZ OPERON szigorúbb szabályozás… ara operon Arabinóz izomeráz - araA - arabinóz → ribulóz Ribulokináz- araB – ribulózt foszforilezi Ribulóz-5-foszfát epimeráz - araD – ribulóz-5-foszfát→xilulóz-5-foszfát, tovább a pentóz foszfát útvonalba.

39 L(+)Arabinóz szükséges az expresszióhoz Glükóz van (nincs cAMP) arabinóz van → expresszió nincs CAP cAMP Ara represszor Ara Ara represszor Az AraC (Ara represszor) represszálja a cAMP kis koncentrációjánál a saját szintézisét és represszálja az AraBAD szintézist, amíg nincs arabinóz.

40

41 Az arbinóz koncentrációjától függ az expresszió mértéke.

42 Indukció drága vegyület nélkül Hőmérséklet növeléssel (ts fehérjék)

43 Pl promótert a cI represszor szabályozza (λ fág)

44 Hömérséklet szabályozás hőérzékeny cI 857 mutáns TARGET GÉN 42 ºC nem-permissziv hőm.; Represszor inaktív Célgén erős expressziója P ºC permisszív hőm.; Represszor stabil A célgénről nincs expresszió Represszor szintézis

45 Triptofán operon – jól ismert

46 TRP operon alapú két-plazmid rendszer Nincs triptofán gén !

47

48 Hova menjen megtermelt fehérje? Inclusion bodies (oldhatatlan) Citoplzma (oldható) Periplazmatikus tér (oldható/oldhatatlan) kiválasztás (!!) E. coli nem tudja

49 Szignál szekvencia Gene III, fd fág periplazmatikus térbe

50 Hogyan tisztítsuk ki a fehérjénket?

51 Fúziós tag segítségével (Invitrogen, Life Technologies, Novagen, QIAGEN): 6xHIS Tag

52 GST – fúzió. Glutationhoz kötődik

53 Új generáció : önmagát levágó fúzió Intein

54 centrális Homing Endonuclease Region az inteinekben, bifunkciós (DNS-t is vág )

55 New England BioLabs, pCYB Vectors/IMPACT System CBD 5kDa chitin-binding domain Bacillus circulans

56 Specifikus proteáz hasító hely Factor Xa Proteáz (Ile-Glu-Gly-Arg)


Letölteni ppt "Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben."

Hasonló előadás


Google Hirdetések