STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea tarnoczai.timea@okbi.antsz.hu 2012. 11. 27.

Mutációk Mindig genetikai eredetű (környezeti vagy endogén hatás) Minél több mutáció jön létre, annál nagyobb a rák kialakulásának valószínűsége Sok vegyi anyag kis dózisban mutagén, nagy dózisban citotoxikus→genotoxikus anyagok

Tautomerizáció

Mutagén tényezők Fizikai tényezők: ionizáló és nem-ionizáló sugárzás Ionizáló: rövid hullámhossz, atomokat ionokká alakítja→vízből szabadgyökök keletkeznek→intenzív oxidáció Determinisztikus (küszöbdózis) és sztochasztikus hatás (vagy kialakul, vagy nem, dózissal nő a valószínűség) Nem-ionizáló: hosszú hullámhossz (pl. UV, timin dimerizáció)

kémiai tényezők: hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek (gyűrűs szerkezetű anyagok, beépülnek) alkiláló vegyületek deamináló vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes párosodni, tranzíciót okoz

Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz pl. salétromossav citozin→uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranzíciót okoz

Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl.etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

Környezeti mutagén anyagok Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidok etilén-iminek acetaldehid Akrilaldehid propán szulfon Dimetil-szulfát Dietil-szulfát dimetil-nitrózamin hidrazinok uretán Etilén-klorid Vinil-klorid élelmiszeradalékok: nitritek, nitrátok nátriumbisziulfit ciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H2O2 femnilén-diamin diaminotoluol diaminoanizol gyógyszerek: citosztatikumok altató és nyugtató szer fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémek azbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

STTA (stable transfected transcriptional activation assay) Endokrin diszruptorok azonosítására OECD 455 guideline Hormonreceptorok citoplazmában Szubsztrát kötődés Dimerizáció és aktiválódás Receptor-ligand komplex DNS promóterhez kötődik→transzkripció aktiválása

STTA assay-ben: hERα-HeLa-9903 sejtvonal Legrégebbi humán sejtvonal Méhnyakrákból származik (Henrietta Lacks) HeLa genetikailag módosított változata→ ösztrogén reszponzív elemek, ösztrogén receptor

DNS-ben szintetikus promóter kötőhellyel Promóter után luciferáz gén→hormon hatású anyag kötődése esetén átíródik Szubsztrát (luciferin) hozzáadása Fény szabadul fel, amit mérni lehet (luminométer) Minél nagyobb a fény aktivitása, annál nagyobb a hormonreceptor hatás (1 μM határig) Pozitív és negatív referencia anyagok (határokon belül!) Pozitív és negatív kontroll

hER: humán ösztrogén receptor ERE:Estrogen-Responsive Element dimerizáció ligandum citoplazma HR sejtmag Full length of hER luciferáz 5’ 3’ ERE hER Luciferin- luciferáz reakcó vegyület 5’ 3’ ERE luciferáz fény Luciferáz aktivitás 10-12 10-11 10-10 10-9 M HR: Hormon Receptor hER: humán ösztrogén receptor ERE:Estrogen-Responsive Element

Bakteriális reverz mutagenitási vizsgálat Bruce Ames 1970-es évek elején Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas (genetikai betegségek) Prokarióta sejtek Aminosav szintetizáló képesség károsodott Öröklött génmutáció reverziója A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció) Minél több mutációt okoz egy anyag, annál valószínűbb, hogy pont az a triplet mutálódik

Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) Metabolikus aktivizálás kívülről Citokróm P450 oxidációs rendszer (májban) S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok Enzim termelődésének növelése→inducer Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll)

Teszttörzsek Escherichia coli és Salmonella typhimurium E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), S. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, TA100, TA1535, TA1537) Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek Negatív és pozitív kontroll kell

Egyéb genetikai módosítások Cél az érzékenység növelése Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia Törzsek ellenőrzése szükséges

Előinkubációs és lemezöntéses módszer Speciális anyagoknál módosítások

A vizsgálat menete 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar Minimál agaros Petri-csészére önteni Top agar megszilárdulása Inkubálás 48-72 óráig 37°C-on Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje 20-40 perc) Telepszámolás, mikroszkópos értékelés Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés)

Aminosav igény ellenőrzése (minimál agar) Ampicillin rezisztencia, kristályibolya- és UV-érzékenység (tápagar) Spontán mutáció (negatív kontroll) Indukált mutáció (pozitív kontroll)

Negatív kontroll, normál baktériumpázsit 25μg/lemez glutáraldehid toxikus hatása

Ames II. módosított Ames vizsgálat 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.) baktériumok és teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) automatizált, kisebb mennyiség is elég

In vivo mikronukleusz Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben OECD Guideline 474 (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz

A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése Normocita→polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk A mikronukleusszal rendelkező eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal

Állatok kezelése subcutan (bőr alatt) vagy per os (szájon át) Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal Kezelés egyszer→leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) Femur preparálás→csontvelő fötális borjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítés

Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal és anélkül Normocita Egy polikromáziás eritrocita az érett eritrociták között

Értékelés mikroszkóppal Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány Statisztikai értékelés