Kapilláris elektroforézis

Definíciók Az elektroforézisnél az oszlop (réteg) két végére elektródokon keresztül feszültség van kapcsolva. Az oldatban lévő ionok a feszültség hatására elmozdulnak az ellentétes pólusú elektród felé. Az ionok töltésüktől és „méretüktől” függő sebességgel mozognak (migrálnak). Az elektroforézis alapjaiban nem kromatográfia, mert nincs megoszlás két fázis között. A minőségi jellemző a migrációs idő (tm) Mennyiségi jellemző a csúcsterület (A)

Ion sebesség és mobilitás Az ionok sebessége arányos a feszültséggel.

Elektroforetikus mozgékonyság függése töltéstől és a súrlódástól

Kromatográfiás módok összehasonlítása

Különböző kölcsönhatási erők szerepe egyes kromatográfiás módokban Ideális kromatográfiás Módok egyes anyagokra GC Könnyenilló, hőstabil vegyületek HPLC Poláros, nehezen illó, hőre bomló vegyületek EKC Ionos vegyületek A gázkromatográfia túlnyomórészt (70-95%) Forrpont szerinti szelektivitást mutat.

Klasszikus gél elektroforézis A feszültség 1-2 kV. Magasabb feszültségnél az oldat felforr a Joule hő miatt. Analízisek több óráig tartanak.

Western blots módszer

Kapilláriselektroforézis készülék diagramja Oszlop: kvarc, 15-70 cm x 0,02-0,075 mm.

A teljes és az effektív oszlophossz

Agilent CE instrument

Kapilláris előnyei az elektroforézisben Nagy hőleadás → nagyfeszültségesés → gyors analízisek → nagy hatékonyság U alakú áramlásprofil On-column detektálás Kevés puffer és minta szükséglet Csekély mintaelőkésztés igény az analízisek közötti gyors, hatékony oszlop regenerálás (0,1 N NaOH) miatt Egyszerű kezelés

A kapilláris kis átmérőjének előnye A puffer tömegéhez képest nagy a kapilláris felülete, ezért intenzív a hőleadás. A nagy hőleadás megakadályozza azt, hogy a molekulák pufferben való áramlásakor keletkező súrlódási Joule hő felforralja a puffer. A nagy sebesség eléréséhez nagy feszültséget (30kV) lehet alkalmazni. A nagy sebesség gyors analíziseket eredményez. A nagy sebesség nagy hatékonyságot (100 000-1000000 tp) biztosít

Nyomelemzések CE-vel A nagy hatékonyság lehetővé teszi több nagyságrenddel különböző csúcsok egymás melletti meghatározását.

CE csekély a mintaszükséglete Mátrix komponensek két analízis között kimoshatók erős vegyszerekkel.

Gyors analízisek A rövid oszlophossz és a pufferben oldott reagens teszi lehetővé a nagy sebességet.

Gyors analízisek Injektálás a rövidebb detektorhoz közeli végén (fordított polaritás). Az elválasztás 15 cm úthosszon történik.

Az elektroozmotikus áramlás kialakulása (EOF) kvarc kapillárisban

A töltéssel elrendeződés és a zeta potenciál kvarc kapillárisnál A kvarc kapilláris felületén lévő szilanol negatív töltéssel rendelkeznek pH 3 fölött.

Az EOF áramlás profilja Az EOF áramlásprofilja laposabb mint a laminárisé, ezért a minta keskenyebb tartományba oszlik el, azaz nagyobb a hatékonysága.

EOF csökkentése és átfordulása pozitív töltésű detergenek hatására Az EOF poliakrilamid vagy teflon borítással is megszüntethető.

Rendszerint az EOF nagyobb az ionok saját migrációs sebességénél A nagysebességű EOF miatt az anionok is a katód felé áramlanak.

A tényleges és a látszólagos mozgékonyság

Az EOF egyenlete

Az EOF függése puffer koncentrációjától és az ionerősségtől

Az EOF függése a pH-tól és a függés hiszterézise Az egyensúlyi szilanol koncentráció beállása időigényes folyamat. A gyakorlatban nem várják meg az egyensúly beálltát, hanem két analízis között lúggal mossák a kapillárist, ezért az EOF értéke reprodukálható.

A különböző kapilláris elektroforézises módszerek Zonális Elektroforézis Izoelektromos fókuszálás Izotahoforézis.

A különböző kapilláris elektroforézises módszerek Zonális elektroforézis: A különböző anyagok eltérő sebességgel haladnak töltésük és méretük szerint. Izoelektromos fokuszálás: A kapillárison pH gradiens van. Az ampholitok (pozitív és negatív töltéssel is rendelkezetnek) az izoelektromos (semleges) pontjuknak megfelelő helyen koncetrálódnak, és nem vándorolnak tovább. Kapilláris izotachoforézis: A vizsgált anyagok vezető és záró elektrolit között foglanak helyet vezetőképességűk sorrendjében, és egyforma sebességgel haladnak.

Zónás kapilláris elektroforézis

Zónás kapilláris elektroforézis Az ionok sebessége függ A töltésüktől Töltésük polaritásától A méretüktől (hidrátburokkal együtt), alakjuktól A feszültségtől Az EOF-től A puffer viszkozitástól

Micelláris elektrokinetikus kromatográfia

Micelláris elektrokinetikus kromatográfia A minta megoszlik a micellák és a háttér puffer között. A micellákba zárt minta migrációs sebessége eltér a háttér pufferben lévő molekulák sebességétől A töltéssel rendelkező micellákkal semleges molekulákat is el lehet választani

A kapilláris elektroforézis alkalmazásai