FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, BME jegyzet, Budapest, 2003. Shimadzu:Introduction to HPLC

Kromatográfiás módok összehasonlítása A HPLC a kis illékonyságú poláris anyagok analízisére legalkalmasabb.

Elválasztás függése a szelektivitástól és a hatékonyságtól HPLC hatékonysága mérsékelt (<100 000N) , de szelektív).

A zónaszélesedés okai HPLC-nél A HPLC-ben a diffúziós folyamatok és az áramlási sebesség sokkal kisebb mint GC-nél.

Van Deemter görbe a HPLC-ben A lassú diffúzió miatt nincs felszálló ág a lassú áramlási sebességeknél.

Nagyhatékonyságú kromatográf (HPLC) vázlata A gázmentesítés (degasser) fontos, hogy a pumpa folyadékot tudjon felszívni, és csökkenjen az alapvonal zaj (noise).

HPLC készülék A pumpák 250 att-ig dolgoznak általában Fontos az oldószer gázmentesítése

Pumpa Pump head Motor & Cam Check valves Plunger Plunger seal

Oldószerkeverék előállítása HPLC pumpával Kisnyomású ágon a pumpa beállított arányban beszívja az eluenseket, amik nagynyomású ágon összekeveredve jutnak az oszlopra.

Folyadékkromatográf pumpája A folyadékáram pulzálását általában két pumpa ellentétes járásával csillapítják

Elúciós gradiens előnye HPLCben A gradiens gyorsabb analíziseket és érzékenyebb detektálást biztosít.

Oldószerek polaritási sora

Forgócsapos (rotary valve) injektálás HPLCben A hurok (loop) pontos mennyiségű, áramlás megzavarása nélküli beinjektálást biztosít.

On-line SPE-HPLC analízis elrendezés Az előoszlopon gyűjtés alatt gyenge a mozgófázis. Lemosás erősebb mozgófázissal történik, de úgy hogy a minta szűk tartományban maradjon a fő oszlop elején.

Poláris növényvédő szerek HPLC analízise

Integrált előoszlop HPLCben Az előoszlop megvédi a fő oszlopot az elkoszolódástól, és a kioldódástól.

HPLCs előoszlop Az előoszlop megvédi a fő oszlopot az elkoszolódástól, és a kioldódástól.

Dead volume Az oszlop csatlakozásnál vigyázni kell a holttér elkerülésére. Male nut Dead volume Tube Excellent connection Poor connection

Szemcseméret és porozitás befolyása a hatékonyságra A hatékonyság annál jobb minél kisebbek a szemcsék, de a nyomásesés határt (3-5 µm) szab a méretcsökkenésnek. A porozitásra a terhelhetőség miatt van szükség. A mély üregek rosszul mosottak. Gömb alakú szemcsék a legelőnyösebbelk.

A kisebb méretű szemcsék alkalmazása a fejlődés iránya

Javasolt pórusátmérő különböző molekulasúlyú mintákhoz Nagyobb molekula súlyú anyag nagyobb pórusátmérőt igényel, hogy a lukba beleférjen.

Különböző HPLC töltetek összehasonlítása Előnyök: monolit > gömbalakú > szabálytalan

Új fejlesztésű szemcse

Normál/Fordított fázis Állófázis Mozgó fázis Normál Magas polsarítású (hidrofil) Alacsony polaritású (hidrofób) Fordított A fordított fázist használják leggyakrabban.

Oszloppolarítás - retenciós idő C18 (ODS) OH weak strong CH3

Borított szilika szemcse szerkezete

A leggyakrabban használt C18 HPLCs állófázis szerkezete Apoláris anyagoknak nagyobb a retenciója. Mozgófázis poláris oldószer (víz, metanol, acetonitril).

Oldószer erőség – retenciós idő fordított fázison Mobile phase: Methanol /Water Methanol / Water 60 / 40 Methanol / Water 70 / 30 Methanol / Water 80 / 20

C18 fázis kondicionálása Metanolos mosás kell, hogy a víztartalmú mozgófázis nedvesítse a C18 állófázist.

Oldószererősség hatása fordított (C18) HPLCs állófázison Az oldószererősség csökkenésével nő a retenció és a felbontás.

Poláris növény védőszerek HPLCs vizsgálata Aminok speciális passziválású állófázist igényelnek

Karbamát és triazin növényvédő szerek HPLC-UV vizsgálata

Normál fázisú, adsorptiós kromatográfia Az állófázisnak csak a felszíne lép kölcsönhatásba

Normál fázisú analízis

Ioncserés kromatográfia elve Az állófázis ionjai visszatartják az ellentétes töltésű ionokat. Az erősebb ionoknak ( Cl- > CO32-) nagyobb a retenciója.

Anionok ionkromatogramja Az állófázis anioncserélő gyanta

Anionok analízise ppb szinten ionkromatográffal szúpresszor segítségével

Gélkromatográfia (gel chromatography, size exclusion chromatography) eleve A nagy molekulák mivel nem férnek be a kis csatornákba kisebb kölcsönhatással bírnak, ezért hamarabb elúálódnak.

Gélkromatográfia (méretkizárásos, size exclusion), alapja A nagy molekulák mivel nem férnek be a kis csatornákba kisebb kölcsönhatással bírnak, ezért hamarabb elúálódnak.

Molecular imprinted phase (MIP) Nagy szelektivitás, gyenge hatékonyság

Karbamát növényvédő szerek HPLC-UV analízise A HPLC-s analízisek előtt a karbamát peszticid tartalmat egy adatként mérték.

Karbamát rovarölő szerek HPLC-UV analízise speciálisan kifejlesztett állófázison Az anyagok hőbomlásuk miatt nem alkalmasak GCs elemzésekre

Különböző detektorokkal elérhető kimutatási határ, és szelektivitásuk jellemzése Electrokémiai Sz Tömeg spektrométer U Fluoreszcens Sz Ultraibolya Sz Törésmutató U Fényszórás U Sz, szelektív; U, univerzális

UV/VIS detektor Ein Eout l A A = e·C·l = –log (Eout / Ein) C C : Concentration Cell Ein Eout A C D2 / W Lamps l A = e·C·l = –log (Eout / Ein) (A : Absorbance)

Diodasoros (DAD) UV-VIS detektor vázlata

Különböző funkciós csoportokhoz ajánlott detektálási hullámhossz HPLC-UV analíziseknél

Fényszórásos HPLC detektor Universális érzékeny detektor

On line HPLC/MS kapcsolat