Kvantumfizikai jelenségek az élet– és orvostudományokban Lumineszcencia: abszorpciós és fluoreszcencia-spektroszkópia Maróti Péter egyetemi tanár, SZTE Ajánlott olvasmányok: Maróti P. és Laczkó G.: Bevezetés a biofizikába, JATEPress, Szeged, 1998. Damjanovich S., Fidy J. és Szőlősi J.: Orvosi biofizika, Semmelweis Kiadó, Budapest 2006. Atkins PW.: Fizikai Kémia I-III. Tankönyvkiadó, Budapest 1992. Maróti P. és Tandori J.: Biofizikai feladatok, JATEPress, Szeged, 1996.

Alapelvek Az egyik legfontosabb nem-invazív optikai spektroszkópiai eljárás: abszorpció- és fluoreszcencia; megfigyelések, alaptörvények, alkalmazások, módszerek, műszerek az élettudományban (is). Molekulák elektron-, rezgési- és rotációs rendszerei; egymásra lapolódó elektron-, vibrációs- és forgási energiaszintek. Az energiaszint-rendszerek és a közöttük megvalósuló átmenetek nevezéktana, szemléltetése (Jablonski-féle termséma) és általános törvények (Franck-Condon elv, Stokes-eltolódás stb.).

A molekula elektron-, rezgési és forgási energiája Emolekula = Eelektron + Erezgés + Eforgás rezgési energia elektron energia Anharmonikus oszcillátor forgási energia Elektron gerjesztési energia Rezgési energiaszintek hullámfüggvény átmenet Alapállapot Benépesítettség szobahőmérsékleten (az energialéptékek nagyon különbözők) at room temperature A forgási energiaszintek olyan kicsinyek és sűrűk, hogy nem tudjuk ebben a léptékben ábrázolni.

A Franck-Condon elv Elektronátmenetek kétatomos molekulában Az elektronátmenetek sokkal gyorsabbak (~1015 s-1), mint az atommagok rezgései (~1013 s-1). Következmények: 1) Az elektronátmenetek függőleges elmozdulást jelentenek a term-sémában, miközben az atommagok koordinátái ezen rövid idő alatt nem változnak. Ez a Franck-Condon elv, amely bonyolultabb molekulák (mint pl. a klorofillok) átmeneteire is igaz. 2) Az atommagok kinetikai energiája nem változik meg az elektron-átmenet alatt. Ez általában azt jelenti, hogy elektron-átmenetek a vibrációs szintek olyan pontjai között jönnek létre, amelyek a parabolán (a falaknál) vannak (A, A’; B, B’; D, D’), hiszen itt az atommagok nyugalomban vannak. Másutt átmenetek csak akkor jöhetnek létre, ha a kezdő és a végállapotok-ban az atommagoknak megegyező a kinetikai energiájuk (pl. C és C’ között). Elektronátmenet A mag „nyugalomban” van Magrezgés Az atommagok koordinátái 3) Minden átmenet kvantált. Ha a gerjesztés (az egyen-súlyi hőmérsékletnek megfelelőnél) magasabb rezgési állapotba viszi a molekulát, akkor (a gerjesztett elektron-állapoton belül) IR kvantum kisugárzásával relaxálódik.

Franck-Condon elv: fluoreszcencia keletkezése Klorofill relaxáció abszorpció fluorescencia Ahol nagy az energia-szakadék, ott a lefele irányuló átmenet (C’C) kevéssé valószínű, esetleg tiltott is. Emiatt a gerjesztett állapot élettartama megemelkedik, és végül egyetlen fluoreszcencia-kvantum kisugárzásával tér vissza az alapállapotba. A relaxációs energia-veszteség miatt a fluoreszcencia spektruma az abszorpcióéhoz képest a vörös (a kisebb energiák) felé tolódik (Stokes-eltolódás).

Fluoreszcencia + Foszforeszcencia Belső konverzió A foszforeszcencia spektruma a fluoreszcenciáéhoz képest a vörös felé tolódik el. Mivel a triplett-szingulett átmenet első rendben tiltott, ezért a foszforeszcencia élettartama nagy. Termikus relaxáció Rendszerek közötti átmenet Abszorpció Foszforeszcencia Lumineszcencia: Fluoreszcencia + Foszforeszcencia tükörszimmetria Stokes-eltolódás vörös-eltolódás A legérdekesebb folyamatok (fluoreszcencia, annak kioltása, energia-transzfer, kémiai reakciók, stb.) az első elektrongerjesztett állapot szobahőmérsékleti rezgési szintjéről indulnak.

Abszorpciós spektrofotometria Alapmennyiségek, definíciók és a Beer-Lambert törvény Transzmisszió: Optikai denzitás (abszorbancia): Beer-Lambert-törvény: l I0 I Jelölések: I0 és I a beeső ill. áthaladó fényintenzitás, c: az oldat koncentrációja (mol/L = M), : a fényút hossza az oldatban (rétegvastagság, cm), ε: moláris (oldatról van szó) dekadikus (a kitevő alapja 10) extinkciós (elnyelési) koefficiens (együttható), rövidebben: abszorpciós együttható (M-1·cm-1) l

Abszorpciós spektrofotométer Fotoelektron-sokszorozó vagy félvezető (pin) fotodióda Volfram szálas izzólámpa, Xe-lámpa, stb. Felváltva engedi át a mérőfényt a mintán és a referencia oldaton. A kétsugaras készülék előnye: csökkenti a fényforrás intenzitásának fluktuációjából (véletlenszerű ingadozásából) származó hibát. Az elrendezés hátránya: lassú (időigényes, míg az érdekelt spektrumtartományon a monokromátor mechanikáját lassan végigforgatjuk). Kiküszöbölés: nagyon intenzív fehér fénnyel megvilágítani a mintát, majd utána felbontani a színeire. Ennek hátránya: a minta (könnyen bekövetkező) kifakítása.

Értelmezések az abszorpciómérésben Vigyázat! Az optikai denzitásnak (OD) a koncentráció szerint logaritmus a léptéke. OD = 1 azt jelenti, hogy 100 beeső foton közül 10 hagyja el (elnyelés nélkül) a mintát. OD = 2 azt jelenti, hogy 100 beeső foton közül 1 hagyja el a mintát, és 99 elnyelődik. OD = 3 nagyon nehéz 999 és 1000 foton között különbséget tenni (ill. mérni). Az OD mérésének hasznos (dinamikus) tartománya: 10 mOD < A < 2 OD. A fluoreszcein festék abszorpciós együtthatója: ε = 72000 M-1cm-1. Ha A = 22 mOD a mért abszorbancia 1 cm-es küvettával, akkor c = 300 nM, ha A = 2,16 OD, akkor c = 30 μM a festék koncentrációja. OD = OD(λ) vagy ε = ε(λ) az abszorpciós spektrum. Az abszorpciós spektrum alatti terület az átmeneti dipólus oszcillátorerősségét (f) adja: ε: molaris abszorpciós együttható, c: a fény sebessége (cm/s), me: az elektron tömege (gramm), e: az elektron töltése (elektrosztatikus egységben, esu), n: a közeg törésmutatója és N0: az Avogadro-szám. Az oszcillátorerősség megmutatja, hogy mennyi elektron rezeg a molekulában a karakterisztikus frekvencián.

A bőr abszorpciós fotometriája A bőr átvilágíthatósága a fény színétől függ. A behatolási mélység az infravörös tartományban a legnagyobb. A bőr különböző rétegeiben különböző abszorpciós tulajdonságú molekulák vannak: Nukleinsavak és aminosavak: UV-C,B (főképp a hámrétegben) Hemoglobin, melanin, karotinok és bilirubin festékek: látható tartomány égési sérülések pigment-képződés fény-carcinogenesis erythema (bőrpír) epidermis dermis subcutaneous layer

A kromofór környezetének vizsgálata abszorpciós spektrofotometriával A fehérjéhez kötött kromofór megfigyelt abszorpciós spektrumát módosíthatják az elektrosztatikus és térbeli kölcsönhatások, amelyek a festék alap- és gerjesztett elektronállapotaiban is előfordulhatnak. Látópigmentek: a rodopszin-család gerjesztett állapot hangolás Vörös az eltolódás, ha a gerjesztett állapot energiája csökken a kölcsönhatás eredményeképp. Kék az eltolódás, ha a gerjesztett állapot energiája nagyobb lesz a kölcsönhatás következtében alapállapot

pálcikák: fekete/fehér látás csapocskák: színes látás recehártya fény pálcikák: fekete/fehér látás csapocskák: színes látás www.isat.jmu.edu/users/klevicca/isat351/vision.ppt

Lemez alakú membrán-rendszer, benne a rodopszin Alapkérdés: A retinálban kémiailag különböző kromofórok vannak vagy csak egy kromofór van, amely azonban a környezetével különböző kölcsönhatásban áll? Pálcika sejt vörös érzékeny Csapocska sejt zöld érzékeny Lemez alakú membrán-rendszer, benne a rodopszin kék érzékeny sejtmag abszorpció hullámhossz (nm) Szinaptikus végződés A rodopszin abszorpciós spektrumai www.isat.jmu.edu/users/klevicca/isat351/vision.ppt

Rodopszin A pálcikák látópigmentje, amely a kis fényintenzitás melletti látásért felelős: max = 500 nm Egy hasonló pigment-fehérje komplex a csapocskákban a színes látásért felelős: max = 414 nm (kék) max = 533 nm (zöld) max = 560 nm (red) Mindegyikben ugyanaz a kromofór: 11-cis retinal és a “spektrális (finom)hangolást” a környezettel (a fehérje közeli aminosavjaival) kialakított kölcsönhatás végzi el. Biochem (2001) 40, 7219-7227

Kék csap Pálcika Zöld csap Vörös csap Relatív abszorbancia A rodopszin abszorpciós spektruma a látósejtek (pálcikák és csapocskák) retinál membránjában www.isat.jmu.edu/users/klevicca/isat351/vision.ppt

A retinál fényindukált konformáció-változása (kémiai izoméria) 7 9 11 6 12 8 10 11-cis retinal h mind trans retinal www.isat.jmu.edu/users/klevicca/isat351/vision.ppt

A rodopszin fehérje szerkezete a retinál kromofór közelében Protonálható Schiff bázis Biochem (2001) 40, 7219-7227

Aminosavak, amelyek mutációival a rodopszin abszorpciós spektruma eltolódik. A membránt átdöfő hélixek Biochem (2001) 40, 7219-7227

A rodopszin spektrumának kék eltolódásáért felelős aminosavak WT: 500 nm G90S: 487 nm T118A: 484 nm E122D: 477 nm A292S: 489 nm A295S: 498 nm T/E/A hármas mutáns 453 nm Vad típus Kék eltolódás T/E/A Értelmezés: pl. G90S A természetes glicin (G) aminosav a 90. sorrendi helyen szerin (S) aminosavra cserélődött. hullámhossz A különböző elektrosztatikus és a térbeli helyigényt kifejező kölcsönhatások mind az alap, mind a gerjesztett állapotokban megváltoztatják a retinál energia-rendszerét, így a spektrumokban változásokat hoznak létre. A mért változásokból a kölcsönhatásokra, térbeli viszonyokra lehet következtetni. Biochem (2001) 40, 7219-7227

Fluoreszcencia spektroszkópia

A fluoreszcenciát jellemző mennyiségek és speciális alkalmazások 1. Emissziós & excitációs (gerjesztési) spektrumok • a lokális környezet polaritása, fluorofór koncentrációja, stb. 2. A fluoreszcencia kvantumhatásfoka • a fluoreszcenciával versengő dezaktivációs folyamatok 3. Az emisszió anizotrópiája (polarizáltsága) (nagyon jelentős, de itt nem tárgyaljuk) • forgási diffúzió 4. A fluoreszcencia élettartama (nagyon fontos, de itt nem tárgyaljuk) • dinamikus folyamatok (nanotartományú időskála) 1. A fluoreszcencia kioltása (Függelék) • oldószer hozzáférhetősége • a lokális környezet tulajdonságai 2. Förster-féle rezonancia energia transzfer (átadás) (FRET) (Függelék) • donor-akceptor távolságok és irányultságok mérése 3. Fluoreszcencia mikroszkópia, sejt-szeparátor • helymeghatározás, és szétválasztás 4. Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) • transzlációs & rotációs diffúzió • koncentráció • dinamika 5. Fluoreszcencia visszanyerése fénykifakítás után (FRAP)

FLUORESZCENCIA SPEKTRUMOK A gerjesztés hullámhosszát rögzítjük, és a fluoreszcencia intenzitását a hullámhossz függvényében ábrázoljuk. kinin szulfát rodamin etídium bromid fluoreszcein Relatív fluoreszcencia-intenzitás hullámhossz

kinin szulfát rodamin fluoreszcein etídium bromid

3 alapmegfigyelés (általános szabály) a fluoreszcencia spektrumra Invariancia-elv: kémiailag egynemű festék oldatának fluoreszcencia spektruma nem függ a gerjesztő fény hullámhosszától. Stokes-féle eltolódási szabály: A fluorszcencia spektrum maximuma (általában „súlypontja”) a kisebb energiák (nagyobb hullámhosszak) felé tolódik el az abszorpciós spektrumának hasonló adatához képest. Ez a megfigyelés az energiamegmaradás elvének következménye. Létezik azonban ú.n. anti-stokes-i gerjesztés is, amikor kisebb energiájú fotonok gerjesztésére nagyobb energiájú fotonok léphetnek ki (lásd ennek lehetőségére a két színkép átlapolási tartományát). Ekkor a fluoreszkáló molekula a környezet (oldat) energiaveszteségének terhére veszi fel az extra energiát. Tükörszimmetria-törvény: a fluoreszcencia spektruma (jó közelítéssel) az abszorpciós színképének a legkisebb frekvenciára, mint tengelyre vonatkoztatott tükörképe. e F  0-0’

A fluoreszcencia gerjesztési (excitációs) színképe Felvétele: rögzítjük a megfigyelés (fluoreszcencia) hullámhosszát, és a gerjesztés hullámhosszát változtatjuk. Az így nyert spektrum a fluoreszcencia gerjesztési színképe. Feltétele: ha az előző 3 alaptörvény fennáll, akkor a fluorofor fluoreszcencia gerjesztési és az abszorpciós spektrumai egybeesnek. F (lgerj)  e (labsz) Egynemű festék esetén jó közelítéssel fennáll, lásd a Jablonski-féle termsémát! Az 1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS) fluorofor gerjesztési és abszorpciós spektrumai etanolban megegyeznek.

A fluoreszcencia kvantumhatásfoka A kvantumhatásfok definíciója: ΦF=kf / (kf+knr), ahol kf és knr a gerjesztett állapot sugárzásos (fluoreszcencia) és nem-sugárzásos dezaktivációs folyamatainak sebesség-állandói. A kvantumhatásfok maximuma 1. Vannak olyan anyagok (fluorescein, rhodamine), amelyek fluoreszcencia hatásfokai megközelítik ezt a maximális értéket. gerjesztett állapot emisszió hő abszorpció knr kf alapállapot

fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) Speciális eljárások: fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) Egy nagyon kicsiny térfogatelemből (≈ 1 femtoliter, 10-15 L) származó fluoreszcencia fluktuációját mérjük, amelyet a térfogatelembe be- ill. kilépő fluorofórok váltanak ki. A fluoreszcencia intenzitásának ingadozását összefüggésbe lehet hozni a fluorofór ott-tartozkodási idejével, és ezen keresztül a diffúziós állandóval. A fluorofórok mozgása a megfigyelt térfogatelemben: gyors lassú gerjesztés emittált foton http://www.probes.com/handbook/boxes/1571.html

Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia: FCS A megfigyelt fluoreszcencia F(t) időfüggéséből az autokorrelációs függvény G() származtatható: amely a fluoreszcencia intenzitásának a t-edik és egy későbbi, (t + τ)-adik időpontban mért értékei szorzatának átlaga. Ha a fluoreszcencia intenzitása gyorsabban fluktuál, mint a kiválasztott késleltetési idő (τ), akkor ez a szorzat nulla lesz (a fluoreszcencia már nem „emlékszik” a kezdeti értékre). F(t) F(t + τ) δF(t) = F(t) - <F(t)> eltérés az átlagos intenzitástól δF(t)=F(t)–<F(t)> átlagos intenzitás: <F(t)> t t + τ

Egyszerű példa: egy fluoreszcencia ligandumnak szabad és fehérjéhez kötött állapotaiban mért autokorrelációs függvényeinek összehasonlítása A szabad/kötött ligandum 1:1 arányú keveréke Lassú mozgású fehérjéhez kötött ligandum G() nullához tart hosszú idő múlva Szabad ligandum (kicsiny és gyorsan diffundál)

1-foton gerjesztés 2-foton gerjesztés

Az adenilat-kináz autokorrelációja –GFP kimér fehérje a HeLa sejtekben Az adenilát-kináz (AK) mindenütt előforduló enzim, amely az adenin nukleotidok homeosztázisát szabályozza a sejtekben. A citoszolban megtalálható adenilát kináz (AK1) és izoformája (AK1beta) zölden fluoreszkáló fehérjével (GFP) vegyülhet, és kiméra fehérjék fejeződnek ki a HeLa sejtekben. Az AK1-GFP és az AK1béta-GFP fehérjéket közvetlenül meg lehet figyelni a sejtben két-fotonos gerjesztésű fluoreszcencia-mikroszkóp segítségével. Az AK1beta-GFP főleg a plazmamembránra lokalizálódik, míg az AK1-GFP a teljes sejtben szétszóródik, kivéve a magmembránt és néhány vezikulát. Fluorescence intensity AK1-GFP fluoreszcencia-képei különböző HeLa sejtekben.

GFP Spektrális hangolás: fehérje-környezet és mutáció A fehérje (gén) az Aequorea victoria medúzából izolálható: Zölden fluoreszkáló fehérje GFP T203Y: a tirozin -elektron-nal kapcsolódik a kromofór aromás gyűrűjéhez, ezzel stabilizálja a gerjesztett állapotot, és vörös felé tolja el a fluoreszcenciát. A SÁRGA fluoreszcencia maximuma: 529 nm. Emellett van még kék (448 nm) és cian (485 nm) fluoreszcenciája is. 3 aminosav fehérjebeli autokatalitikus reakciója: O2 -nel kiváltott ciklizáció és oxidáció

Autokorrelációs függvények Az GFP és adenilát kináz –GFP komplex autokorrelációs függvényei GFP-AK1 citoszolban GFPoldat GFP-AK1b citoszolban GFPsejt AK1b-GFP komplex a sejt citoplazmájában és a membránjában. 1-nél több diffúziós állandó (idő)

Az adenilát kinázb – GFP komplex autokorrelációja HeLa sejtekben citoszol plazma membrán Az AK1-GFP komplex csak egy diffúziós komponenst mutatott a citoplazmában. Az AK1beta-GFP komplex ellenben legalább két diffúziós összetevőt sejtet a plazma membránban. Az egyik a fehérje szabad diffúziójának felel meg, míg a másik a membránoz kötött AK1beta-GFP fehérjét képviseli. Az AK1-GFP diffúziós sebessége 1,8-szorosára csökkent a GFP-hez képest, amely azonban 50%-kal több, mint amit szabadon diffundáló AK1-GFP esetén várnánk. Az FCS technika alkalmas (megjelölt) fehérjék mozgásának és kölcsönhatásának kvantitatív tanulmányozására élő sejtekben. A színkód különböző diffúziós együtthatókat jelent a 7 - 17 μm2/s (kék, citoszol) és 0.12 – 0.18 μm2/s (sárga, membrán) tartományokban.

További speciális fluoreszcencia eljárások: A fluoreszcencia intenzitásának visszanyerése a sejtnek fénnyel történő kifakítása után, Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Fehérjék diffúziójának mérése E. Coli baktériumok citoplazmájában. Vigyázz, kész.. Tűz! Fehérjék diffundálnak a kifakított területre t1 E. coli sejt t0 t2 1. Fejeztessünk ki a sejtben a sejttel egy fehérjét, amely maga is fluoreszkál: pl. zölden fluoreszkáló fehérje, GFP. 2. Vakítsuk ki intenzív lézer fénnyel a fluoreszkáló fehérjéket egy sejt megadott tartományában! A kifakítás (roncsolás) végleges. 3. Mérjük a fluoreszcencia intenzitását erről a területről, miközben a szomszédból fokozatosan intakt fehérjék diffundálnak be.

GFP diffúziója E. coli intakt sejtben. Eredmények: D = 7.7 µm2/sec (7.7 · 10-8 m2/sec) Ez az érték 11-szer kisebb, mint a vízben mért diffúziós együttható: 87 µm2/s A lassú transzlációs diffúzió a „tömegelés”-nek tudható be, mert a baktérium citoplazmájában nagyon magas a fehérje koncentrációja (200 -300 mg/ml). Egyedi sejt, termeltetett GFP A sejt közepének fénykifakítása lézerrel, t0 t = 0,37 s-mal a kifakítás után t = 1,8 s-mal a kifakítás után 4 µm Jól megfigyelhető az ép molekulák diffúziója a korábban kifakított területre. J. Bacteriology (1999) 181, 197-203

Fluoreszcencia spektroszkópia és a SEX A papagáj tollazatának fluoreszcenciája a nemi érdeklődés felkeltését elősegítő jelzés! Fehér fény UV megvilágítás Science (2002) 295, 92

Mélytengeri medúza vészhelyzetben Biolumineszcenciával fénykereket működtet, hogy a ragadozó figyelmét lekösse.

Telepes medúza 2000 m-re a tenger felszíne alatt Telepes medúza 2000 m-re a tenger felszíne alatt. Csaliként alkalmazott biolumineszcencia halak befogására (Science, 2005. július 8.) Vörös színű biolumineszcencia (nem fény, hanem kémiai reakciók gerjesztik).

Szemináriumi feldolgozásra ajánlott problémák A nukleotidok 250 nm körüli sávja polinukleotidokban 5 nm exciton (Davydov-) felhasadást szenved a szomszédokkal való erős kölcsönhatás eredményeképp. Mekkora ez a kölcsönhatási energia kJ/mol egységben, ha feltételezzük, hogy csupán dimérek képződnek? A donor saját fluoreszcenciájának élettartama τf = 2 ns (nincs jelen akceptor). Mennyi a tényleges (megfigyelt) élettartam az akceptor koncentrációjának függvényében? A Förster-rádiusz R0 = 3 nm. Egy dinamikai kioltást vizsgáló kísérletben különböző kioltó-koncentrációnál ([Q]) az alábbi fluoreszcencia intenzitás-értékeket (F) mértek: Mekkora a Stern-Volmer kioltási állandó? 4. Határozza meg két, egymásba alakuló anyag (A ↔ B) izoszbesztikus pontját! Az egyensúlyi állandó Keq, az abszorpciós spektrumok Gauss-függvények, amelyek maximum helyei 500 nm és 520 nm, szélességei 50 és 70 nm és maximum-értékei 2·104 M-1cm-1 és 4·104 M-1cm-1 a két anyagra. [Q] (mM) 1 2 4 8 F (arb. units) 10.5 9.1 8.5 7.1 5.3

Szemináriumi feldolgozásra ajánlott problémák 5. A triptofán és tirozin aminosavak oldatai alkalikus körülmények között (100 mM KOH) az egymástól eltérő UV abszorpciós spektrumaik alapján jól vizsgálhatók. A moláris abszorpciós együtthatóik (M-1cm-1egységben) ilyen viszonyok mellett 240 nm és 280 nm hullamhosszaknál 10 mg glucagon fehérjét összetevő aminosavjaikra hidrolizálunk, és 100 mL térfogatra hígitunk ki 100 mM KOH-ban. Az oldat optikai denzitása 1 cm küvettában 0,717 (240 nm-nél) és 0,239 (280 nm-nél). Becsülje meg a fehérje triptofán és tirozin tartalmát μmol/(g fehérje) egységben! 6. A fotoszintézisnek a CO2 megkötésére vonatkozó tiszta (nettó) reakciója CO2 + H2O → (CH2O) + O2 ahol (CH2O) a szénhidrogén (pl. glükóz) molekula 1/6-át jelöli. Az endotermikus reakció entalpia-változása ΔH = +485 kJ/mol megkötött CO2 molekulánként. A klorofill a hosszúhullámú abszorpciós maximuma in vivo 680 nm. Mennyi a megvilágítás intenzitásának legkisebb értéke (einstein egységben, azaz a mol fotonok számában), amelynek elnyelése 1 mol CO2 megkötéséhez szükséges energiát még biztosítani tudja? Mennyi a folyamat fotokémiai kvantumhatásfoka, ha (a kísérletek szerint) 9 foton szükséges 1 molekula CO2 megkötéséhez? Tyr Trp 240 nm 11300 1960 280 nm 1500 5380

Szemináriumi feldolgozásra ajánlott problémák 7. A pH-indikátor egy olyan festék (D), amelynek spektruma pH-függő. DH+ ↔ D + H+ Az alábbi abszorpciós együtthatók írják le az indikátor festéket (pK = 4) a festék ionizált (DH+) és nem-ionizált (D) alakjaiban: Hullámhossz (nm) Moláris absz. együttható, ε (1/(M·cm)) DH+ D 400 10000 420 15000 2000 440 8000 460 12000 480 3000 Az indikátor oldatában az alábbi optikai denzitásokat mértünk 1 cm-es küvettában: λ (nm) 400 420 440 460 480 O.D. 0.250 0.425 0.400 0.300 0.075 Számítsuk ki az oldat pH-ját! Mennyi az oldat abszorbanciája 440 nm-en és pH 6,37 értéknél, ha az indikátor mennyisége változatlan az oldatban?

Szemináriumi feldolgozásra ajánlott problémák 8. Az M abszorbeáló reaktáns egy P (szintén) abszorbeáló terméket ad az alábbi reakcióval: Mutassuk meg, hogy a rendszernek nincs izoszbesztikus pontja még akkor sem, ha az N közbülső terméknek nincs mérhető abszorpciója a kérdéses spektrumtartományban! 9. Hasonlítsa össze a radioaktivitás és a fluoreszcencia detektálásának érzékenységét! A 32P bomlási ideje 14,3 nap. Mennyi a bomlások mp-enkénti száma 1000 db 32P atom esetén? A fluoreszcein festék moláris abszorpciós állandója 70000 1/(M·cm) 485 nm-nél, és a fluoreszcencia kvantumhatásfoka 0,93. Mennyi a moláris abszorpciós hatáskeresztmetszet cm2 per molekula egységben? 1000 fluoreszcein molekulát argon lézerrel világítunk meg. A lézer intezitása 2 mW/cm2, hullámhossza 485 nm. Mennyi a mp-enként kisugározott fluoreszcencia fotonok száma? Elemezze a kis számú molekula detektálásának egymáshoz viszonyított lehetőségeit (előnyeit és hátrányait) a két (radioaktivitás/fluoreszcencia) esetben! Milyen más tényezőket kellene még a számlálási sebességen kívül figyelembe venni?

Szemináriumi feldolgozásra ajánlott problémák 10. A tengeri búvár nagyobb mélységekben fényszegényebb világba kerül. Tegyük fel, hogy a tengervíz moláris abszorpciós együtthatója a látható tartományban 6,2·10-5 1/(M·cm)! Számítsuk ki azt a mélységet, amelynél a búvár (a) fele akkora (b) tized akkora fényintenzitást észlel, mint a tenger felszínén!

Függelék Noha ezek az anyagok nem sorolhatók az alapkövetelmények közé, nem kívánnak az átlagosan elvártnál nagyobb matematikai felkészültséget, a tudást elmélyítik, az eddig elhangzottakat más megvilágításba helyezik, és így bátran ajánlhatók az érdeklődő hallgatóknak.

Mitől függ a fényelnyelés (abszorpció) mértéke Mitől függ a fényelnyelés (abszorpció) mértéke? Az elektronpályák szimmetriája és átlapolása, a spin multiplicitása. (A molekulák kémiájától a spektroszkópiájáig) Korábbi és más jellegűnek gondolt ismeretek felfrissítése. Hogyan állnak össze az atomi pályák molekulapályákká? Ragadjunk ki csupán egyetlen (egyszerű) példát, a H2C=O formaldehid molekulát! Az s és p atomi elektronpályák sigma, π, n, és nem-kötő (taszító) π* molekulapályákat hoznak létre (lásd később részletesen). Vegyük észre, hogy az n nem-kötő molekulapályák az oxigénatom „magányos” elektronjait tartalmazzák, amelyek nagyon kitettek, és így érzékenyek az oldószerhatásokra. A O és C atomok két pz pályái két pályává kapcsolódnak, amelyek közül az alacsonyabb energiájú a kötő π pálya, míg a nagyobb energiájú az anti(nem)-kötő π* pálya. Foton elnyelésével az elektron az n pályáról a π* vagy az alacsonyabb energiájú π pályáról a π* pályára kerülhet. Ezeket az átmeneteket n-π* és π- π* átmeneteknek hívjuk. Ilyen átmeneteket nem csupán ebben az egyszerű szerves molekulában találunk, hanem a biológiai makromolekulákban (pl. fehérjékben, nukleinsavakban stb.) is előfordulnak, sőt meghatározóak azok spektroszkópiájában.

Molekulapályák, energiaszintek és elektronátmenetek PÉLDA Molekulapályák, energiaszintek és elektronátmenetek Formaldehid A gerjesztett állapot taszítópályái A pályák energiaszintjei

A formaldehid molekula atomi- és molekulapályái H 1s 1 elektron H 1s 1 elektron C 1s2 (2sp2)32pz 6 elektron O 1 s2 2s2 2p2x 2py 2pz 8 elektron C-H kötések alakulnak ki a két H atom s elektronjai és a szén két 2sp2 hibridje között. A szénatom harmadik sp2 pályája σ kötést létesít az oxigén 2px pályájával. A maradék pályák: 2pz a C-re és 2pz és 2py az O-re. Molekulapálya alakulhat ki az oxigén 2pz és a szén 2pz pályái között (csak egyetlen elektronnal betöltött pályák). Az oxigén maradék 2 elektronja a 2py atomi pályát tölti be (nem-kötő n pályák). A formaldehid két legmagasabb betöltetlen állapota a kötő π pálya és az oxigén atomi n (2py) pályája. A π* energiaszintet két átmenettel is betölthetjük: az egyik az n állapotból, a másik a π állapotból indul. Az átmenetekhez szükséges energiát a molekula a besugárzó fényből nyeri. Az egyes átmenetekhez különböző elnyelőképeség („abszorpciós intenzitás”) tartozik, amelyet az átmeneti dipólusmomentum változás mátrixelemének kiszámításával határozhatunk meg (itt nem számítjuk ki).

, n és * pályák *  *  - * n - *  Formaldehid 1e- H: 1s 6e- C: 1s22s22px2py 1s2(2sp2)32pz1 8e- O: 1s22s22py22px2 1s2(2sp2)52pz1 *  * 2pz(C) + 2pz(O) n  - * n - *  gerjesztett állapot alap állapot gerjesztett állapot Carey, Organic Chemistry, 1987

Energiaszintek, betöltöttségek és átmenetek formaldehid molekulában belső konverzió gerjesztés visszatérés az alapállapotba

Excitonok és energia-átadás (energia-transzfer) Förster-féle rezonancia energia-átadás A B kt = kf·(R0/R)6 R = R0 esetén (Förster-rádiusz) kt = kf Gerjesztett állapot h kf alapállapot A B A gerjesztési állapot vándorol A B „A” dezaktiválódik vagy fluoreszcencia, kf vagy energia-átadás, kt útján „A” gerjesztése Ha gerjesztés átadása gyors, akkor nem lokalizálódik egyetlen molekulára. A gerjesztett állapot A-ra és B-ra (vagy több molekulára) kiterjed. Ezt az abszorpciós spektrumban exciton sáv megjelenése jelzi. Az energia-transzfer az excitonnak molekulák közti diffúziós folyamatának tekinthető. Ha gerjesztés átadása lassú (108 s-1), akkor már jól mérhetően egy-egy molekulára lokalizálódik. Az energia-transzfer mérése lehetőséget ad két kromofór közti távolság (R) kísérleti meghatározására: FRET (Förster’s Resonance Energy Transfer)

Kromofórok kölcsönható dipólusai. Három egyszerű geometriai elrendezés. Rezgő dipólusok ábrázolása rugókkal I. Kártya-csomag geometria II. Fej-farok geometria III. Halszálka geometria mA mB harmonikus rezgések mA mB mA mB

+   I. Kártya-csomag geometria E - - - + plusz és + + + - Oszcillátorerősségek: f f 2·f fázisban ellentett fázisban rezegnek az oszcillátorok Fázisban: a közeli azonos töltések taszítása azt eredményezi, hogy emelkedik az átmenet energiája. Az átmeneti dipólusok összeadódnak, ezzel növekszik az átmenet oszcillátorerőssége. Ellentett fázisban: az átmenet energiája kisebb lesz az ellentétes töltések közeli helyzete miatt. Az átmeneti dipólusok egymást kiejtik, ezért ez az átmenet tiltott, és nem is láthatjuk. kék felé   asszociátumok monomer A dimer AA polimer + monomer dimer polimer S1 S0 f 2f E

II. Fej-farok geometria + és + - + - + - - + oszcillátor- erősségek f f 2·f fázisban ellentett fázisban megengedett, alacsonyabb energia (vörös eltolódás) tiltott (kék eltolódás) monomer dimer f 2·f E vörös felé  e monomer dimer

III. Halszálka geometria + - - - + + + - Oszcillátor-erősségek: f f Σ f ≠ 0 Σ f ≠ 0 fázisban Nagy energia Megengedett átmenet ellentett fázisban Alacsony energia Megengedett átmenet monomer dimer E Ezt Davydov (exciton-) felhasadásnak hívják   monomer dimer

A molekuláris komplex-képződés az abszorpciós spektrumban eltolódásokat eredményezhet. PÉLDA antocianin komplexek, amelyek a virágok és a gyümölcsök színét adják, és a teljes látható spektrumtartományt befedik. anthos + kyanos = virág + kék

Ok: nem-kovalens hidrogén hidakkal összetartott antocianin-komplexek Exiton csatolások (sávok) sok esetben felelősek a virágok és a gyümölcsök változatos színének kialakulásáért. Ok: nem-kovalens hidrogén hidakkal összetartott antocianin-komplexek A commelinin összetétele: 6 antocianin (A/kék) és 6 flavocommelin (F/sárga) PNAS (2001)98, 10042-10045

Modell: dimelamin-ból és barbituat-ból álló szintetikus komplex PNAS (2001)98, 10042-10045

A komplex „kártya-csomag” geometriát mutat: Kihígítással a komplex szétesik (disszociál), és megváltoztatja a színét: sáv-eltolás következik be az abszorpciós spektrumban nincs komplex (10-6 M) Figyelem: ISOSZBESZTIKUS PONT Minden spektrum átmegy egy közös ponton komplex (10-3 M) A komplex „kártya-csomag” geometriát mutat: A komplex kialakulásával a spektrum a kék felé tolódik. PNAS (2001)98, 10042-10045

Az izoszbesztikus pont megfigyelése arra utal, hogy a rendszerünkben csak két, egymásba átalakuló forma található, amelyek egyensúlyban vannak. Az izoszbesztikus pont jelenléte annak bizonyítéka, hogy nincs (jelentős koncentrációban) közbülső termék (intermedier) a kiinduló anyag (reaktáns) és a végtermék (produktum) között. Ennek alapja: ha 3 vagy több speciesz lenne, akkor annak valószínűsége nagyon kicsiny lenne, hogy legyen olyan hullámhossz, amelynél az abszorpcióik megegyeznek. [A] [B] Ctot = [A] + [B] Abszorbancia = [A]Ad + [B]Bd Abszorbancia = (fracACtot) Ad + (fracBCtot) Bd Ha A = B (az izoszbesztikus pontban), akkor Abszorbancia = isoCtot(fracA + fracB)d és mivel (fracA + fracB) = 1,0, így az Abszorbancia = isoCtotd nem változik, miközben az A és B aránya változik. Az abszorbancia (OD) állandó az izoszbesztikus pontban A B

Bakterioklorofill dimer: Davydov (exciton) felhasadást figyelhetünk meg a hosszúhullámú abszorpciós spektrumban Vörös sáv Kék (Soret) sáv in 1/(M·cm) Zöld ablak Monomerikus és dimerikus bakterioklorofill oldat abszorpciós színképe. Sáveltolás több átmenetnél, de sávfelhasadás csak a leghosszabb hullámhosszú sávban következik be. JACS 88:2681 (1996)

A purin és pirimidin bázisok * átmeneteinek megfelelő UV sávok A -* átmeneti dipólusok a purin és a pirimidin bázisok aromás gyűrűinek síkjaiban fekszenek. A purin és pirimidin bázisok * átmeneteinek megfelelő UV sávok Számított sávok

Hiper- és hipokromizmus akkor következik be, amikor az A molekulában létrejövő elektronátmenet kölcsönhat egy közeli B molekula különböző (kisebb vagy nagyobb energiájú) átmeneteivel. A B A B A B Érdekes kvantummechanikai következmény: ha a kölcsönhatást figyelembevevő közös hullámfüggvényt az egyes molekulák magasabb gerjesztett állapotaihoz tartozó hullámfüggvényeiből építjük fel (kombináljuk), akkor előállhat az (abszorpciós) intenzitások kölcsönvételének (cseréjének) jelensége is. A kölsönhatások eredményeképp a különböző átmenetek oszcillátorerősségei növekedhetnek vagy csökkenhetnek. Hiperkromizmus Hipokromizmus

A Kuhn-Thomas-féle összegzési szabály + Az abszorpciós görbe alatti teljes terület állandó.   A molekuláris kölcsönhatások növelhetnek vagy csökkenthetnek egyes sávokat, de a spektrum alatti teljes területet a molekuláris kölcsönhatások nem befolyásolják. Pl. a nukleinsavak hipokromizmusa: ha a spektrum egyik tartományában csökken az abszorpció, akkor egy másik tartományban növekednie kell. A szigorú rendeződés azt eredményezi, hogy az UV sáv intenzitása csökken, de egyúttal növekszik a távoli UV sáv intenzitása. +

Egy példa a hipokromizmusra: a 260 nm-nél mért csökkenő abszorpció a DNS-ban és az RNS-ben bekövetkező rendeződés eredménye. Mononukleotidok Egyszálú és rendezetlen DNS Kétszálú és rendezett DNS Abszorbancia Hullámhossz (nm)

A natív DNS-nak kisebb az abszorpciója 260 nm-nél. A kétszálú DNS (E. coli) megfolyásának nyomonkövetése a 260 nm-nél mért abszorpció segítségével: a hipokromizmus alkalmazása. A natív DNS-nak kisebb az abszorpciója 260 nm-nél. Egyszálú DNS (magas hőmérséklet) Relatív abszorbancia, Adenat/Anat (260 nm) Kettős szálú DNS (alacsony hőmérséklet) Hőmérséklet (oC)

Fluoreszcencia

A fluoreszcencia emisszió és a vele versengő folyamatok 2’’ S2 Akceptor molekula 1’’ 0’’ Energia-átadás IC 0’ 1’ 2’ S1 IC T1 IX ABS F 3 IC S0 ABS = abszorpció Q = kioltás IC = belső átalakulás IX = rendszerek közötti átmenet F = fluoreszcencia P = foszforeszcencia PHOTOCHEM = fotokémia 2 P IX Q PHOTOCHEM 1

Kb. 10 ps = 10-11 s-en belül minden molekula hővesztéssel az első gerjesztett elektronállapot legalsó rezgési energiaszintjére kerül. S2 2’’ 1’’ 10-11 s: belső konverzió; a „forró” molekula hőmennyiséget ad le a környezetének (az oldatnak) 0’’ hő 0’ 1’ 2’ S1 10-8 s: a nagy energetikai távolság miatt sokkal lassúbb a gerjesztett elektron-állapotból az alapállapotba való lecsengés (relaxáció) hő abszorpció fény 3 S0 2 1

Oldószer molekulákkal való ütközés A molekula gerjesztett állapotában a „túlgerjesztés” miatt a környezeténél magasabb hőmérsékleti állapotba kerülhet, amelytől oldószermolekulákkal való ütközéssel szabadulhat meg (trermikus relaxáció). A belső konverzió sebességét az oldószermolekulákkal való ütközés gyakorisága és hatékonysága határozza meg. ütközési sebesség = kütk [oldószer] ~1010 M-1 s-1 az oldószer koncentrációja vízre 55 M Vízben (55 M) egy molekula ütközési sebessége  1011 -1012 s-1 S2 S1 S0 A kis energia-különbség miatt az ütközések nagyon hatékonyak, ezért 10-11 s alatt minden molekula „lehűl” a legkisebb (a termikus egyensúlynak megfelelő) rezgési energiaszintre. Ezzel szemben, az alapállapotba irányuló (nem sugárzási) energiaveszteség (belső konverzió) a nagyobb energia-ugrás miatt sokkal lassúbb.

Foszforeszcencia a legalsó gerjesztett triplett állapotból (ahol azonos irányítottságúak az elektronspinek) történő fotonemisszió S2 2’’ 1’’ 10-11 s: belső konverzió 0’’ hő 10-8 s: rendszerek közötti átmenet; spin-átfordulás, szigulett → triplett átmenet 0’ 1’ 2’ S1 T1 abszorpció fluoreszcencia 3 foszforeszcencia 10-6 - 10- 2 s: triplett → szingulett átmenet S0 2 1

Mit tudunk meg a fluoreszcenciából? kI (minden egyéb átmenetre) kf A fluoreszcencia versenyben áll minden egyéb dezaktivációs folyamattal. Ha a dezaktivációs folyamatok gyorsabbak, mint a fluoreszcencia lecsengése, akkor kisebb fluoreszcenciát fogunk megfigyelni. Fordítva: minél kisebb a konkurencia, annál intenzivebb a fluoreszcencia. Számos olyan folyamat ismert, amely a molekula gerjesztett állapotának időtartama alatt versenybe száll a fluoreszcenciával, és ezzel annak intenzitását befolyásolja: (1) Ütközések (kioltás) hozzáférhetőség (2) Az energia átadása távolság (3) Az oldószer relaxációja az oldószer polaritása (4) A kromofór forgása molekuláris méret és viszkozitás

S2 S1 S0 (1) kabs: - abszorpció, amely az átmeneti oszcillátorerősséggel arányos - Nagyon gyors, nagyságrendje 1015 s-1 (2) Belső konverzió (IC): - Termikus relaxáció (újra-eloszlás) a szingulett energiarendszeren belül - Nem sugárzási átmenet: az energia az oldószerrel való ütközéssel adódik át. kIC  1011 -1012 s-1 Az S1állapot legalacsonyabb rezgési energiszintjére irányul.

S2 S1 S0 (3) Fluoreszcencia: kf  108 sec-1 a fény spontán emisssziója (4) Ütközési események: Kioltás: bizonyos (ú.n. kioltó)molekulákkal való ütközés megnöveli a nem-sugárzási relaxáció gyakoriságát (sebességét) Excimer kialakulása: ha egy alapállapotbeli molekula (X) egy olyannal ütközik, amely gerjesztett elektronállapotban van (X*), akkor olyan komplex (XX)* képződhet, amelynek a molekuláétól nagyon különböző emissziós tulajdonságai vannak.

Ütközési események h X X* X* + Q X + Q + hő kQ X + Q XQ Keq X* (XQ)* Gerjesztett állapot, amelynek élettartama ~10-8 s (1) Dinamikus kioltás: Gerjesztett állapotbeli ütközés: foton elnyelés után X* + Q X + Q + hő kQ amely különbözik a statikus kioltástól: Alapállapotbeli komplex: a foton elnyelése előtt alakul ki. X + Q XQ Keq h h X* (XQ)* fluoreszcencia Nincs fluoreszcencia (2) Excimer kialakulása: Gerjesztett állapotbeli komplex: foton elnyelése után X* + Y (XY)* fluoreszcencia fluoreszcencia

Fluoreszcencia kioltás Az ütközés sebessége: kQ ·[X*][Q] az X* gerjesztett állapot és Q között. A leggyorsabb ütközések diffúzió-limitáltak. Dinamikus kioltás: ütközés a gerjesztett állapottal 1. X + h  X* 3. X*  Q + h’ kQ kf 2. X* + Q  X + Q + hő abszorpció X* kQ = az ütközési kioltás másodrendű sebességállandója 50Å kQ maximuma kb. 1010 M-1s-1 Ha [Q] = 1 M, akkor minden X* molekula másodpercenként 1010 –szer ütközik. Q So S1 kf [Q]·kQ kI X* a gerjesztett állapotának ~ 10 ns időtartama alatt ütközik egy olyan Q kioltóval, amely egy X* középpontú és 50 Å sugarú gömbön belül van.

Dinamikus kioltás, a Stern-Volmer ábrázolás So S1 kf [Q]·kQ kI Nincs kioltó: Φfo = kf kf + kI + kioltó: Φf = kf + kI +kQ·[Q] A fluoreszcencia hatásfokok hányadosa: Φfo Φf Fo F kf kf + kI kf + kI +kQ[Q]  = • = 1 + kQ[Q] kf + kI = 1 + kQo[Q] = 1 + K·[Q] Fo F K = Stern-Volmer állandó kQ = kioltási állandó Stern-Volmer ábrázolás Φf: fluoreszcencia hatásfok F: fluoreszcencia intenzitás 2 Fo F meredekség = K 1 [Q]

Példa: A triptofán fluoreszcenciájának kioltása fehérjékben - Az első bizonyítékok egyike a fehérjék dinamikájára - Válassz ki egy olyan fehérjét, amelyben csak egyetlen eltemetett triptofán van! - Oltsd ki a fluoreszcenciáját (a) Jód ionnal (I-) vagy (b) O2 molekulával (hogy nagy legyen az [O2] koncentráció, használj nagy nyomású oxigént)! Kísérlet: Eredmény: (1) A triptofánok elérhetetlenek a I- ionok, de nem az O2 molekuláknak. (2) A probléma csak az, hogy a röntgen-szerkezet alapján nincs elég hely a fehérjében az oxigénmolekuláknak! Lakowicz + Weber. Biochem (1973) 12, 4161 - 4171 Következtetés: A röntgendiffrakció alapján megadott szerkezeti kép a fehérjéről csak statikus átlagot mutat. A fehérjének ki kell nyílnia, és be kell záródnia olyan időskálán, amely elegendő időt ad az oxigénmolekulának, hogy beléphessen a fehérje belsejébe.

S2 S1 S0 R (5) Energia-átadás: ktrans kt = kf·(R0/R)6 szingulett - szingulett vagy FÖrster X* Y R X elnyel, és Y fluoreszkál (6) Rendszerek közötti átmenet: kIX ~ lassú, spin-tiltott kIX (S1 T1) ~ 108 s-1 széles tartományban változhatnak kIX (T1 S0) ~ 102 s-1 (7) Foszforeszcencia: kP Sugárzásos átmenet (T1 S0) : lassú és spin-tiltott (ms-tól percekig) A foszforeszcencia a fluoreszcenciához képest a vörös tartomány felé tolódott.

S2 S1 S0 (8) Fotokémia: kCHEM A földi élet alapja; a fénygerjesztés hatására a kovalens kötések átrendeződnek. A legismertebb biológiai példák - Fotoszintetizáló növények/baktériumok reakciócentrum-fehérjéje (lásd korábban) - Retinal a rodopszinban és a bakteriorodopszinban A fény hatására kiváltott cis-trans izomerizáció a kezdőlépés olyan fontos bioenergetikai folyamatokban, mint a látás (rodopszin) vagy a proton-pumpálás (bakteriorodopszin).

A fluoreszcencia mérésének leggyakoribb módjai Steady state (állandósult, időtől független) mérés fényforrás (folytonos) monokromátor polarizátor minta fluoreszcencia detektor detektor az abszorpció mérésére Dinamikai módszerek Impulzus spektroszkópia: nagyon rövid (ns, ps) fényimpulzus hatására kiváltott fényemisszió intenzitásának, polarizációfokának, stb. mérése. Ezen belül: Fázis- és modulációs spektroszkópia: a fluoreszcencia élettartamának meghatározására. See Ann. Rev. Biophys Bioeng. (1984) 13, 105-124