OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2016

Az előadások a következő témára: "OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2016"— Előadás másolata:

1 OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2016
Fluoreszcens jelzőanyagok (KM), szept.21. Fotokróm anyagok (BP), szept. 28. 3. Fémkomplexek lumineszcenciája (BP), okt. 5. 4. Fotodinámiás terápia (VT), okt. 12. 5. Fluoreszcenciás képalkotó eljárások (VT), okt. 19. 6. Közeli infravörös spektroszkópia és mikroszkópia (GSz), okt. 26. 7. Királis anyagok optikai spektroszkópiája (KM), nov. 2.

2 ALAPISMERETEK (vizsgára, doktori szigorlatra átismételni)
Kémiai anyagszerkezettan V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05) VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05) VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05) X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)

3 Jablonski-diagram

4 A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben
1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál

5 Fluoreszcens festékpróbák Cél: a mikrokörnyezet jellemzése a fluoreszcencia sáv
J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999

6 Vázlat  Műszerek stacionárius spektrofluoriméter
időkorrelált egyfoton-számlálás Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása  Polaritás szenzorok  Viszkozitás szenzorok  Fehérjék fluoreszcenciája / triptofán Távolságmérés: FRET

7 Spektrofluoriméterek
stacionárius időfelbontásos (F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás)

8 Stacionárius

9 Gerjesztési és emissziós spektrum
Gerjesztési sp: hasonlít az abszorpciósra, S0 →S1, S0 →S2, ∙∙∙ átmenetek sávjai Emissziós sp: csak S1 →S0, IF készülékfüggő!

10 Fluoreszcencia kvantumhatásfok
F meghatározása - integráló gömbbel - standarddal X: minta R: standard IX,IR a fluoreszcenciasávok integrált intenzitása AX, AR abszorbanciák a gerjesztés hullámhosszán nX, nR törésmutatók

11 Időkorrelált egyfoton-számlálás

12 Fluoreszcencia lecsengési görbe
IRF

13 Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása

14 Na+ indikátor CoroNa Green

15 Na+ ionok eloszlása idegsejtben,
Na+ indikátor Na+ ionok eloszlása idegsejtben, mikroszkópos kép CoroNa Green alkalmazásával, W. J. Tyler et al. , PlosOne 3, e3511 (2008)

16 Gerjesztési spektrumot mérnek, ott max eltolódik
Na+ indikátor SBFI Gerjesztési spektrumot mérnek, ott max eltolódik Szelektív: a Na+ a K+ mellett is mérhető SBFI = sodium-binding benzofuran isophthalate

17 Na+ indikátor SBFI-vel festett idegsejt

18 Klorid indikátor MQAE Szelektív: nitrát, foszfát nem oltják ki, Br-, I- igen Működése dinamikus kioltáson alapszik

19 Klorid indikátor Kloridion eloszlás idegsejtekben IF kép FLIM: fluorescence lifetime imaging

20 Dinamikus kioltás: Stern-Volmer egyenlet
M + h M + h M +  M* M + Q

21 A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka
Kioltó nélkül Kioltóval

22 Stern-Volmer egyenlet

23 Polaritás szenzorok nílus vörös
water, - methanol - ethanol - acetonitrile - dimethylformamide, 6. acetone - ethyl acetate - dichloromethane - n-hexane - methyl-tert-butylether - cyclohexane - toluene.

24 Szolvatoktromizmus: a szín függ az oldószertől

25 Algasejtből nyert lipid testecskék rendeződése
A sejtmembrán sérülése után új sejtek képződnek A minta nílus vörössel festve: a membrán (lipid) sárga Kim G H et al. J Cell Sci 2001;114:

26 „charge transfer (CT)” festékek
Oldószer polaritás

27 Polaritás hatása: Lippert-egyenlet
+ _ 2a G v. E

28 Lippert-egyenlet + G v. E _ 2a

29 Naftilamin-származékok Stokes eltolódása
etanol-víz oldószerelegy Lakowicz, p. 191

30 Viszkozitás szenzor

31 Festékmolekula orientációs relaxációja (rotációs diffuzió)
Stokes-Einstein-Debye egyenlet f alaktényező (gömbalakra f = 1) C súrlódási tényező (0<C<1, ha a részecske nagy az oldószermolekulákhoz képest C ~ 1) környezet viszkozitása VM molekula térfogat T hőmérséklet k Boltzmann állandó

32 Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán
Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága () 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát

33 or mérése: a fluoreszcencia depolarizáció időfüggését mérjük

34 Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán

35 Kettős fluoreszcencia: twisted intramoleculat charge transfer = TICT
DMANCN fl. színképe etilénglikolban, a két sáv int. aránya viszkozitásfüggő Lakowicz, p. 201

36 Fluoreszkáló aminosavak
fenil-alanin tirozin triptofán

37 Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma
(víz, pH 7) Lakowicz, p. 446

38 A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára
Apoazurin Pfl T1 ribonuclease staphillococcus nuclease glucagon Lakowicz p. 453

39 Lakowicz, p. 461

40 Lakowicz, p. 461

41 Rezonancia energia-átadás
(Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV-fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők

42 Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz
Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.

43 Ha D és A távolsága kicsi, FRET,
D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r6-nal arányos

44 Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata
C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)

45 Akceptor Donor: EtBr (etidium bromid)

46 BODIPY fluoreszcencia
EtBr abszorpció

47 Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni