Enzimkinetika Komplex biolabor 2016..

Az előadások a következő témára: "Enzimkinetika Komplex biolabor 2016.."— Előadás másolata:

1 Enzimkinetika Komplex biolabor 2016.

2 Biokatalizátorok

3 Enzim működése E+S k1 ES k2 E+P k-1

4 Michaelis-Menten kinetika
E+S k1 ES k2 E+P k-1 Egyszerűsítés: Az enzim és a szubsztrát között pillanatszerűen gyors reakcióban kialakul az ES komplex Egyensúlyi állandó (KS) (nem-kovalens E-S kölcsönhatás esetén disszociációs állandó) ES komplex termékké bomlásának üteme, a katalitikus sebességi állandó, amelynek jelölése kcat (itt: kcat=k2), lényegesen alacsonyabb értékű, mint az egyensúlyi állandóban rejlő sebességi állandók - a termék irányú bomlás olyan alacsony ütemű, hogy (a mérés során) praktikusan nem befolyásolja az [E], [S] és [ES] egyensúlyi koncentrációkat

5 Hogy függ a kezdeti sebesség a szubsztrát koncentrációjától?
Elsőrendű kémiai reakció: termékkeletkezés sebessége kizárólag az ES komplexnek a koncentrációjával arányos Kezdeti, nulla időpillanathoz tartozó reakciósebesség: nem számolunk azzal, hogy az enzimből és a termékből a fordított irányú reakcióból szintén ES jöhet létre, mivel a reakció legelejét vizsgáljuk, amikor még nem keletkezett termék ES koncentrációja nem ismert - enzim és szubsztrát-koncentrációk ismertek - ki kell fejeznünk az ES koncentrációt a kísérletben beállított, tehát ismert koncentrációkkal. Szabad enzimkoncentráció, a teljes enzimkoncentráció, és az ES komplexben lévő enzimkoncentráció között összefüggés:

6 Egyensúlyi állandó: Enzimkoncentráció: Az ismeretlen ES koncentrációt az ismert teljes enzimkoncentráció, a szabad szubsztrát koncentráció, és az egyensúlyi állandó segítségével fejeztük ki. Ha a teljes szubsztrát koncentráció nagyságrendekkel meghaladja a teljes enzimkoncentrációt, úgy az a szubsztrát mennyiség, amely ES komplexbe kerül, elhanyagolható lesz az összes szubsztrát mennyiségéhez képest. Emiatt a szabad szubsztrát koncentráció (a reakció elején) praktikusan megegyezik majd a teljes szubsztrát koncentrációval

7 Kezdeti reakciósebesség:
ES koncentráció: A maximális sebességi értéket, amelynek jelölése Vmax, akkor kapjuk, ha az összes enzim ES komplexben van - a szubsztrát telíti az oldatban jelenlévő enzim molekulákat - ekkor [ES] = [ET]  kcat ET szorzat tehát nem más, mint maga a Vmax

8 Továbbfejlesztett modell
A továbbfejlesztett séma már számol az enzim és a szubsztrát ES komplexhez vezető reakciójának sebességi állandójával (k1), valamint az ES komplex enzimre és szubsztrátra történő visszaalakulásának sebességi állandójával (k-1) Stacionárius modell:

9 A bomlás egyrészt végbemehet a termék kialakulásának irányában k2 sebességi állandóval, illetve ezzel ellentétes irányban, szabad enzimet és szubsztrátot eredményezve k-1 sebességi állandóval k1[E][S] sebességgel keletkezik az ES komplex, amely visszafelé k-1[ES] sebességgel, termék irányban pedig k2[ES] sebességgel bomlik. A keletkezés és a kétirányú elbomlás eredő sebessége, vagyis az ES komplex koncentrációjának változása nulla A termékkeletkezés üteme: Stacionárius állapot kialakulása: Enzimkoncentráció:

10 Enzimkoncentráció: Michaelis-Menten konstans

11 a KM azt mutatja meg, hogy milyen arányban van az ES komplex kétirányú elbomlásának és egyirányú keletkezésének az üteme az elérhető legmagasabb, Vmax sebességi értéket akkor kapjuk, ha az összes enzim ES komplexben van, vagyis [ES] = [E]T. A egyenletben szereplő k2ET szorzat tehát nem más, mint a Vmax (Feladat: határozzuk meg a kezdeti sebességeket)

12 Enzimkinetika alapegyenlete – Michaelis-Menten
egyenlet (hiperbolát ír le) (Feladat: ábrázoljuk a kezdeti sebességeket a szubsztrát koncentráció függvényében) KM gyakorlati jelentése: az a szubsztrát koncentráció, ahol a reakció sebessége eléri a maximális reakciósebesség felét

13 A Michaelis-Menten egyenlet reciproka (Lineweaver–Burk)
Kettősreciprok ábrázolás: (Feladat: ábrázoljuk a reciprok függvényt, határozzuk meg a maximális sebességet és a Michaelis-konstanst)

14 Tripszin akivitás mérése
Tripszin: hasnyálmirigy enzim, peptidkötések hidrolízisét katalizálja BAPNA (szintetikus szubsztrát) – paranitroanilin szabadul fel (405nm elnyelési maximum) Reakcióelegyek (mikrol) 1 2 3 4 5 6 Tris 1000 200 mM BAPNA 10 20 20 mM BAPNA Tripszin