Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

TALAJVIZSGÁLAT KATALÁZ AKTIVITÁS MÉRÉSSEL Enzimvizsgálati módszerek 1.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "TALAJVIZSGÁLAT KATALÁZ AKTIVITÁS MÉRÉSSEL Enzimvizsgálati módszerek 1."— Előadás másolata:

1 TALAJVIZSGÁLAT KATALÁZ AKTIVITÁS MÉRÉSSEL Enzimvizsgálati módszerek 1

2 A kataláz enzim (1)  A kataláz gyakori enzim, mely szinte minden élő szervezetben megtalálható, ami oxigénnek van kitéve. 2

3 A kataláz enzim (2)  Katalizálja a hidrogén-peroxid lebomlását vízzé és oxigénné.  Egy kataláz enzim 40 millió hirdogén-peroxid molekulát tud vízzé és oxigénné bontani.  4 azonos polipeptid láncból felépülő enzim, minden egység több, mint 500 aminosav hosszú.  Működési mechanizmusa: 3

4 A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (1)  A kataláz funkciója a mérgező hidrogén-peroxid bontása: H 2 O 2 → H 2 O + 1/2 O 2  A gerjesztett hidrogén-peroxid mérgező a sejtekre, oxidálja a fehérjék SH-csoportjait.  Az aerob sejtek rendszerint tartalmazzák a szuperoxid dizmutáz enzimet, mely átalakítja a szuperoxidot hidrogén-peroxiddá és molekuláris oxigénné: 2O 2 - 2H + → H 2 O 2 + O 2 4

5  Az L- és D-amino sav oxidáz redukált formái közvetlenül képesek reoxidálódni hidrogén peroxid formába molekuláros oxigénnel: E-FMNH 2 + O 2 → E-FMN +H 2 O 2 E-FADH 2 + O 2 → E-FAD +H 2 O 2  Minden aerob baktérium és a fakultatív anaerob baktériumok zöme foglal magában kataláz aktivitást.  Az enzim nem észlelhető obligált anaerob baktériumokban.  A kataláz volt az első enzim, amit vizsgáltak a talajban. Ez alapozta meg az O 2 kibocsátás meghatározását. A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (2) 5

6  A kataláz aktivitást észlelték növényi és állati sejtekben.  Ráadásul, a Mn és a Fe, valamint a szerves anyagok a talajokban katalizálják az O 2 felszabadulását a hidrogén-peroxidból.  A kataláz aktivitás nagyon stabil a talajban. Ezt mutatják a fontos összefüggések a szerves szén tartalommal és a talaj mélységének csökkenésével.  Nem találtak összefüggést a kataláz aktivitás és a talaj termékenysége között A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (3) 6

7 Az eljárás alapelve  A módszer a talaj hidrogén-peroxiddal, három percig, szobahőmérsékleten történő inkubálása után felszabaduló oxigén térfogatbecslésén alapul. 7

8 Anyagok és segédeszközök  Erlenmeyer lombikok (200ml)  Mágneses keverő  Scheibler berendezés  Ha a Scheibler berendezés nem érhető el, egy U-üveg cső, Brodie oldattal töltve felhasználható a térfogat mérésére. 8

9 Vegyszerek és oldatok  Foszfát puffer (0,2 M, pH 6,8) Oldjunk 35,63 g Na 2 hidrogén fosztfátot 700 ml desztillált vízben, igazítsuk a pH-t 6,8-ra HCl-el és 1000 ml desztillált víz higítással.  Nátrium karbonát oldat (10%) Oldjunk 100g Na 2 CO 3 -ot körülbelül 800 ml desztillált vízben és öntsük fel desztillált vízzel 1000 ml-ig.  H 2 O 2 (3%) Közvetlenül a használat előtt készítsük elő.  Nátrium azid oldat (6,5%) 6,5 g 100 ml-1 desztillált víz  Brodie oldat  MnO 2 9

10 Az eljárás (1)  Helyezzünk 5-10 g nedves vagy száraz talajt egy Erlenmeyer lombikba (200 ml) és adjunk hozzá 20 ml foszfát puffert.  Készítsük elő az ellenőrzőket, adjunk hozzá 2 ml azid oldatot és 20 ml foszfát puffert.  Forgassuk meg a lombikot és hagyjuk állni 30 percig.  Pipettáljunk 10 ml H 2 O 2 -ot (3%) a Scheibler berendezés kis tartályába.  A lombik bezárása után keverjük a hidrogén-peroxidot a talaj mintával és inkubáljuk folytonos keverés mellett 3 percig szobahőmérsékleten (20 o C). 10

11 Az eljárás (2)  Majd olvassuk le a gáz térfogatváltozását a Scheibler berendezésben vagy az U-üveg csőben.  Az átalakult oxigén meghatározásához tegyünk 0,5 g MnO 2 és 20 ml nátrium karbonát oldatot (10 %) a talaj helyett egy Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 10 ml H 2 O 2 -ot (3 %) és olvassuk le a térfogat változását a Scheibler berendezésben (vagy az U- üveg csőben).  Az átalakult oxigént tekintjük 100 %-nak. 11

12 Számítás Ahol:  D 0 az azid hiányában fejlődő O 2 mililiterben,  D A azid jelenlétében fejlődő O 2 mililiterben,  D Mn a Mn jelenlétében fejlődött O 2 mililiterben,  dwt a talaj száraz tömege (%). 12

13 Diszkusszió  Az azid használható az abiotikus H 2 O 2 hidrolízis számításához.  A nedves vagy levegőn szárított talajok szobahőmérsékleten 4 hónapig raktározva nem mutatnak kataláz aktivitást.  A peszticidek gátolhatják vagy aktiválhatják is a talaj kataláz aktivitását, az összetételtől függően.  Összefüggést találtak a kataláz és a dehidrogenáz aktivitás között, azonban a kataláz és az amiláz aktivitás vagy a baktérium szám között csupán gyenge az összefüggés, vagy nincs. 13

14 Források  Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995  Catalase:http://en.wikipedia.org/wiki/Catalasehttp://en.wikipedia.org/wiki/Catalase  A kataláz enzim szerkezete és működése: df (20.oldal) df  Catalase structure:  Növényélettan jegyzet: marssoniella.uw.hu/4elettan.doc  AP Biology Lab 2: Enzyme catalysis: enzyme-catalysis.html enzyme-catalysis.html 14


Letölteni ppt "TALAJVIZSGÁLAT KATALÁZ AKTIVITÁS MÉRÉSSEL Enzimvizsgálati módszerek 1."

Hasonló előadás


Google Hirdetések