Talajvizsgálat kataláz aktivitás méréssel

Az előadások a következő témára: "Talajvizsgálat kataláz aktivitás méréssel"— Előadás másolata:

1 Talajvizsgálat kataláz aktivitás méréssel
Enzimvizsgálati módszerek

2 A kataláz enzim (1) A kataláz gyakori enzim, mely szinte minden élő szervezetben megtalálható, ami oxigénnek van kitéve.

3 A kataláz enzim (2) Katalizálja a hidrogén-peroxid lebomlását vízzé és oxigénné. Egy kataláz enzim 40 millió hirdogén-peroxid molekulát tud vízzé és oxigénné bontani. 4 azonos polipeptid láncból felépülő enzim, minden egység több, mint 500 aminosav hosszú. Működési mechanizmusa:

4 A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (1)
A kataláz funkciója a mérgező hidrogén-peroxid bontása: H2O2 → H2O + 1/2 O2 A gerjesztett hidrogén-peroxid mérgező a sejtekre, oxidálja a fehérjék SH-csoportjait. Az aerob sejtek rendszerint tartalmazzák a szuperoxid dizmutáz enzimet, mely átalakítja a szuperoxidot hidrogén-peroxiddá és molekuláris oxigénné: 2O2- 2H+ → H2O2 + O2

5 A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (2)
Az L- és D-amino sav oxidáz redukált formái közvetlenül képesek reoxidálódni hidrogén peroxid formába molekuláros oxigénnel: E-FMNH2 + O2 → E-FMN +H2O2 E-FADH2 + O2 → E-FAD +H2O2 Minden aerob baktérium és a fakultatív anaerob baktériumok zöme foglal magában kataláz aktivitást. Az enzim nem észlelhető obligált anaerob baktériumokban. A kataláz volt az első enzim, amit vizsgáltak a talajban. Ez alapozta meg az O2 kibocsátás meghatározását.

6 A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (3)
A kataláz aktivitást észlelték növényi és állati sejtekben. Ráadásul, a Mn és a Fe, valamint a szerves anyagok a talajokban katalizálják az O2 felszabadulását a hidrogén-peroxidból. A kataláz aktivitás nagyon stabil a talajban. Ezt mutatják a fontos összefüggések a szerves szén tartalommal és a talaj mélységének csökkenésével. Nem találtak összefüggést a kataláz aktivitás és a talaj termékenysége között

7 Az eljárás alapelve A módszer a talaj hidrogén-peroxiddal, három percig, szobahőmérsékleten történő inkubálása után felszabaduló oxigén térfogatbecslésén alapul.

8 Anyagok és segédeszközök
Erlenmeyer lombikok (200ml) Mágneses keverő Scheibler berendezés Ha a Scheibler berendezés nem érhető el, egy U-üveg cső, Brodie oldattal töltve felhasználható a térfogat mérésére.

9 Vegyszerek és oldatok Foszfát puffer (0,2 M, pH 6,8)
Oldjunk 35,63 g Na2 hidrogén fosztfátot 700 ml desztillált vízben, igazítsuk a pH-t 6,8-ra HCl-el és ml desztillált víz higítással. Nátrium karbonát oldat (10%) Oldjunk 100g Na2CO3-ot körülbelül 800 ml desztillált vízben és öntsük fel desztillált vízzel 1000 ml-ig. H2O2 (3%) Közvetlenül a használat előtt készítsük elő. Nátrium azid oldat (6,5%) 6,5 g 100 ml-1 desztillált víz Brodie oldat MnO2

10 Az eljárás (1) Helyezzünk 5-10 g nedves vagy száraz talajt egy Erlenmeyer lombikba (200 ml) és adjunk hozzá 20 ml foszfát puffert. Készítsük elő az ellenőrzőket, adjunk hozzá 2 ml azid oldatot és 20 ml foszfát puffert. Forgassuk meg a lombikot és hagyjuk állni 30 percig.  Pipettáljunk 10 ml H2O2-ot (3%) a Scheibler berendezés kis tartályába. A lombik bezárása után keverjük a hidrogén-peroxidot a talaj mintával és inkubáljuk folytonos keverés mellett 3 percig szobahőmérsékleten (20 oC).

11 Az eljárás (2) Majd olvassuk le a gáz térfogatváltozását a Scheibler berendezésben vagy az U-üveg csőben. Az átalakult oxigén meghatározásához tegyünk 0,5 g MnO2 és 20 ml nátrium karbonát oldatot (10 %) a talaj helyett egy Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 10 ml H2O2-ot (3 %) és olvassuk le a térfogat változását a Scheibler berendezésben (vagy az U- üveg csőben). Az átalakult oxigént tekintjük 100 %-nak.

12 Számítás Ahol: D0 az azid hiányában fejlődő O2 mililiterben,
DA azid jelenlétében fejlődő O2 mililiterben, DMn a Mn jelenlétében fejlődött O2 mililiterben, dwt a talaj száraz tömege (%).

13 Diszkusszió Az azid használható az abiotikus H2O2 hidrolízis számításához. A nedves vagy levegőn szárított talajok szobahőmérsékleten 4 hónapig raktározva nem mutatnak kataláz aktivitást. A peszticidek gátolhatják vagy aktiválhatják is a talaj kataláz aktivitását, az összetételtől függően. Összefüggést találtak a kataláz és a dehidrogenáz aktivitás között, azonban a kataláz és az amiláz aktivitás vagy a baktérium szám között csupán gyenge az összefüggés, vagy nincs.

14 Források Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 Catalase: A kataláz enzim szerkezete és működése: df (20.oldal) Catalase structure: Növényélettan jegyzet: marssoniella.uw.hu/4elettan.doc AP Biology Lab 2: Enzyme catalysis: enzyme-catalysis.html