Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

 az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható  allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: " az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható  allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik."— Előadás másolata:

1

2  az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható  allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik  allosztérikus: az enzim nem csupán a szubsztrátkötésre alkalmas katalitikus hellyel rendelkezik, hanem még egy vagy több más, olyan hellyel is, ahol kicsiny, a szubsztráttól eltérő szerkezetű, szabályozó molekula, effektor vagy ligand megkötése válik lehetségessé (allosztéria = más alakú)  az ATP a legfontosabb molekula a sejtekben lejátszódó energia leadó és felvevő folyamatokban, az elhalt sejtekben az ATP gyorsan degradálódik → a mikrobiális aktivitás becslésére használható paraméter  a talajból kivonható, majd mennyisége meghatározható

3  legelterjedtebb: az ATP biolumineszcens reakciója segítségével (luciferin-luciferáz rendszer)  gyors módszer  nagyon érzékeny kimutatás  HPLC módszerrel  nem elterjedt  sok időt vesz igénybe az analízis  drága a szükséges felszerelés

4 A lumineszcencia olyan kémiai folyamat, ahol a molekula energia hatására gerjesztett állapotba kerül, majd alapállapotába visszajutva, fényt bocsát ki.  az ATP a biokémiai reakció során luciferin-luciferáz enzimpreparátum hatására lebomlik, miközben biolumineszcencia (fénykibocsátás) történik  az enzim reakcióba lép az élő szervezetek – mikrobák – energiataroló komponensével, az ATP-vel  a reakció során oxiluciferin-luciferáz-AMP komplex képződik, amely oxidálódik  a gerjesztett állapotban levő átmeneti komplex (*-gal jelölve) energiatöbbletét a normál állapotba visszatérve foton formájában adja le

5  A kibocsátott fény - műszeresen – luminométer segítségével detektálható  minél erősebb a fényintenzitás, annál magasabb az ATP-tartalom, a mérés rendkívül érzékeny, hiszen g ATP már kimutatható

6  Előnyök:  rendkívül kis mennyiségű ATP jelenléte már nagy biztonsággal kimutatható  rendkívül gyors vizsgálati módszer (a reakció 10 másodpercen belül lejátszódik)  Hátrányok:  az ATP extrakciós hatásfoka erősen függ  a használt extraháló szertől  az ATPáz és ATP kináz enzimek inaktivitásának sebességétől és intenzitásától  az ATP adszorpciójától a talaj szerves és ásványi kolloidokon  a talaj kivonatokban található különböző vegyületeknek (pl. NO 3 - Mg 2+, Ca 2+, Cl - ) gátló hatása lehet a luciferáz aktivitására  néhány vegyület (pl. Fe 3+ ) komplexet alakít ki az ATP-vel  a talajban az ATP-t ki lehet vonni növények gyökereiből és állati sejtekből is a mikrobiális sejtek mellett (az az ATP interferál a mikrobiális aktivitással) Sok fajta ATP extrakciós módszert használnak:  az egyik ilyen: a TCA (triklóracetát) extrakciós módszer

7 Szükséges anyagok és készülékek  luminométer és küvetták  ultrahangos és egy 12.5 átmérőjű szonda  minicentrifuga (Eppendorf centrifuga és csövek)  jégfürdő  szűrő (Whatman 44)  pH mérő  finnpipetta és steril csíkok  üvegcsövek  polipropilén vagy üveg centrifuga csövek Szükséges anyagok és oldószerek  EDTA-magnézium arzenát puffer  TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat  Luciferin-luciferáz keverék  belső standard ATP-oldat (10 -3 M) A módszer elve: az ATP extrakciója a talajból triklóracetát- foszfát- paraquat keverék segítségével, majd a kivont ATP mennyiségi meghatározása a luciferin-luciferáz rendszerrel

8  EDTA-magnézium-arzenát pufferoldat  1.oldat: 31,2 g Na 2 HAsO 4 ·7H 2 O-et kell feloldani 800 ml vízben, majd hozzáadni 10 ml 0,2 M EDTA oldatot  2. oldat: 2,46 g MgSO 4 ·7H 2 O-t kell feloldani 100 ml desztillált vízben  a két oldatot össze kell önteni és 7,4-es pH-ra beállítani 1 M kénsav segítségével, majd 1000 ml-re kiegészíteni desztillált vízzel, hogy az oldat 0,1 M legyen az arzenátra nézve, 10 mM a Mg 2+ -ra és 2 mM az EDTA-ra  TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat  81,6 g TCA-t és 89,6 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O-t kell feloldani 600 ml desztillált vízben  25,8 g paraquat-dikloridot (1,1-dimetil-4,4-bipiridilium-diklorid) kell feloldani 100 ml desztillált vízben és ezt a TCA-Na 2 HPO 4 oldathoz adni  az így elkészült oldatot vízzel ki kell egészíteni 1000 ml-re, hogy az oldat 0,5 M legyen a TCA-ra nézve, 0,25 M a foszfátra és 0,1 M a paraquatra  Az oldat pH-ja 1,6 lesz és -15 ºC-on kell tárolni

9  Luciferin-luciferáz keverék  a tisztított luciferáz és a D-luciferin liofilizált keverékét fel kell oldani 2 ml desztillált vízben injekciós üvegenként a gyártó utasításai szerint (Packard Instrument Co.)  ATP belső standard oldat (10 -3 M)  5,07 g savmentes ATP-t kell feloldani 7 ml steril extraháló szerben, majd kiegészíteni az extraháló szerrel 10 ml-re  minden 0,5 ml ATP oldatot helyezzük egy-egy steril Eppendorf csőbe és tároljuk -20 ºC-on

10  ATP extrakció  4 adag nedves talaj mintát (<2 mm szemcseméret), amelyek mind 2,5 g szárított talajt tartalmaznak, be kell mérni 50 ml-es polipropilén (vagy üveg) centrifugacsőbe és jégen kell hagyni  25 ml hideg TCA-foszfát-paraquat extrahálószert kell adni mindegyik kémcsőbe  Két kémcsőbe belső standard ATP oldatot kell tenni  ezek után a talajt 1 percig kell szonikálni a 12,5 mm átmérőjű szondában a Branson Sonifier B12 készülékkel, a szonda csúcsa 1 cm- re legyen a folyadék felülete alatt  az ultrahangos kezelés után a kémcsöveket hűteni kell jégen legalább 5 percig, majd szűrni  a szűrt kivonatokat lehet tovább használni

11  Az ATP meghatározása  a talajszűrletethez (50μl) hozzá kell önteni 5 ml EDTA-MG arzenát pufferoldatot és jégen tartani a törzsoldatot  a luciferin-luciferáz keverékből 50μl-t a küvettába kell pipettázni, majd a luminométeren lemérni ezt a vakmintát (az intenzitása nem lehet nagyobb 150 RLU/10 s-nál, RLU (relative light unit))  ezután 250 μl-t kell adni a jegelt törzsoldatból a küvettába, majd háromszor mérni egy percen belül a készülékkel a minta intenzitását  A kalibrációs görbe  A belső standard ATP oldatból küvettákban hígítással kell készíteni egy sorozatot, amelyek ATP koncentrációja rendre legyen 10 -5, 10 -6, és M  majd mérni ezen kalibrációs minták intenzitását

12  ATP (μg)/ dwt (g) = (A*ATP S *40) / (B-A)  A: a talajszűrlet minta intenzitása  ATP S : hozzáadott belső standard mennyisége [μg]  B: a belső standard oldatból készült minta intenzitása  dwt: a száraz tömege 1 g nedves talajnak  A paraquat használata nem szükségszerű, mivel hozzáadása csak segíti az extrakciós hatásfok javítását. Nagy hátránya a használatának, hogy erősen mérgező anyag és drága is.  Nem lehet alkalmazni ezt a módszert, ha a talaj több, mint 10% CaCO 3 tartalmaz (semlegesíti a TCA-oldatot)  Vizsgálat előtt el kell távolítani a mintából a látható növényi gyökereket és az állati szöveteket, mert a módszer az ezekben található ATP-t is megméri.

13  Élelmiszervizsgálati közlemények (1997. XLIII. kötet 2. füzet)   Redox-potenciál mérésén alapuló gyors mikrobiológiai módszer validálása és ipari alakalmazhatóságának vizsgálata - Nádaskiné dr. Szakmár Katalin   Mikrobiális fiziológia – Novák Béla  ulacio.pdf  Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995  Estimation of adenosine triphosphate in soils  The trichloroacetic acid extraction method


Letölteni ppt " az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható  allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik."

Hasonló előadás


Google Hirdetések