Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

MONOCLONAL ANTIBODIES versus POLYCLONAL ANTIBODIES.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "MONOCLONAL ANTIBODIES versus POLYCLONAL ANTIBODIES."— Előadás másolata:

1 MONOCLONAL ANTIBODIES versus POLYCLONAL ANTIBODIES

2 Polyclonal antibody response Ag Immunserum Polyclonal antibody Ag Set of B-cells Activated B-cells Antibody- producing plasma-cells Antigen-specific antibodies

3

4 Monoclonal antibodies - product of one B-lymphocyte clone - homogeneous in antigenspecificity, affinity, and isotype - can be found in pathologic condition in humans (the product of a malignant cell clone) - advantages against polyclonal antibodies: antibodies of a given specificity and isotype can be produced in high quantity and assured quality. -therapeutic usage of monoclonals: anti-TNF-α therapy in rheumatology, tumor therapy

5 Polyclonal antibodyMonoclonal antibody (high affinity) Number of recognized antigen determinants several (frequent cross- reactions) mostly one Specificitypolyspecificmonospecific AffinityVarying (diverse antibodies) high Concentration of non- specific immunoglobulines highlow Cost of preparationlowhigh StandardisabilityImpossible (or uneasy)easy Amountlimitedunlimited Applicabilitymethod-dependentexcellent Features of polyclonal and monoclonal antibodies

6 Possible use of monoclonal antibodies - Identifying cell types Immunohistochemistry Characterization of lymphomas with CD (cluster of differentiation) markers - Isolation of cells Isolation of CD34+ stem cells for autologous/allogeneic transplantation (from peripheral blood!) - Blood group determination (with anti-A, anti-B, and anti-D monoclonals) - Identification of cell surface and intracellular antigens Cell activation state - Targeted chemotherapy CD20+ anti-B-cell monoclonals in non-Hodgkin lymphoma Prevention of organ rejection after transplantation

7 Monoclonal antibodies as drugs? Mouse monoclonal antibodies may elicit an immune response upon administration in human subjects. (see immunogenicity-determining factors!) How can we solve this problem?

8 Evolution of monoclonal antibodies Mouse Chimeric Human Humanized Humanized antibodies are antibodies from non-human species whose protein sequences have been modified to increase their similarity to antibody variants produced naturally in humans.

9 PROTECTED SUBJECT serum antibody PASSZÍV IMMUNIZÁLÁS This is a case of PASSIVE IMMUNIZATION Immune system is not activated prompt effect temporary protection/effect Immunoglobulin degradation Human immunoglobulin transgenic mouse immunization mouse monoclonal antibodies ENDANGERED SUBJECT immunization human monoclonal antibodies humanized mouse monoclonal antibodies

10 Tumor therapy - Tumor therapy Monoclonals can be used for targeted chemotherapy of tumors. It is cell-type specific, but not specific to malignant cells! -Immunsuppressive monoclonals Cell-type specific immunsuppression Monoclonals as drugs

11 Monoclonals in tumor therapy 1.„Naked MAb”, unconjugated antibody Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, chimeric): B-cell Non-Hodgkin lymphoma Anti-CD52 (campath – Mabcampath, humanized): chronic lymphoid leukaemia Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanized): breast cancer Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanized): colorectalis tu. (+ Lucentis!) Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, chimeric): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) 2.Conjugated antibody Anti-CD20 + yttrium-90 isotope (ibritumomab- Zevalin) Anti-CD20 + iodine-131 (tositumomab – Bexxar)

12 Immunsuppressive antibodies 1. 1.Anti-TNF-α antibodies infliximab (Remicade): since 1998, chimeric adalimumab (Humira): since 2002, recombinant human 2.Etanercept (Enbrel) – dimer fusion protein, TNF-α receptor + Ig Fc-part Not a real monoclonal antibody, no Fab end, the specificity is given by TNF-receptor! Indications of anti-TNF-α therapy: Rheumatoid arthritis Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) Psoriasis vulgaris, arthritis psoriatica Crohn-disease, colitis ulcerosa (usually - still – not in the first line!)

13 kombinált „szendvics” ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok, vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). A nem kötődő anyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása felesleges ellenanyagok kimosása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása citokintartalmú minta hozzáadása felesleges konjugátum kimosása

14 Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Standard Protein minta SDS-PAGE Membrán Western blot Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján WESTERN BLOT

15 Lézer FALS Sensor FSC Fluoreszcencia detektorok (PMT3, PMT4, stb.) autofluoreszcencia - piridinek és flavinok jelenléte miatt Áramlási citometria

16 Transzplantáció

17

18 AUTOLÓG SZERV, SZÖVET VAGY SEJT TRANSZPLANTÁTUM Bőr, izom, őssejt, dendritikus sejt, porc VÉRÁTÖMLESZTÉS Csontvelő eredetű hematopoetikus őssejt (HSC) autograft isograft SZINGÉN ALLOGÉN Vese, cornea, máj, szív, tüdő Csontvelő eredetű hematopoetikus őssejt (HSC) allograft

19 1.Az elsődleges T sejt készlet zöme MHC-specifikus (V gének) 1-2% egy allotípusra 2.A T sejt készlet fókuszálása a saját MHC felismerésre) 3.A felesleges klónok eltávolítása 4.Az önveszélyes klónok eltávolítása 5.KÖZPONTI TOLERANCIA 6.A T sejt készlet fókuszálása az idegen felismerésre 7.Egyénre szabott optimalizált T sejt készlet a periférián 8.A CD4 és a CD8 részt vesz a pozitív szelekcióban αβTCR CD4+ CD8+ A T LIMFOCITÁK SZELEKCIÓJA A TÍMUSZBAN Tok alatti terület Kéreg Kéreg/velő határ IL-7 függő osztódás β+preTα CD4-CD8- DN CD4+CD8+ DP Velő TCRαβ TCR- sMHC+sP sMHC+iP iMHC+iP  szelekció – szelekció  – AICD nincs  PERIFÉRIÁS TOLERANCIA AICD – aktiváció indukált apoptózis

20 AZ ALLO-REAKTÍV IMMUNVÁLASZ A TRANSZPLANTÁCIÓS ANTIGÉNEK ELLEN IRÁNYUL –A fő transzplantációs antigéneket a klasszikus MHC gének kódolják –A minor transzplantációs antigéneket bármely polimorf gén kódolhatja –A vércsoport antigének szövet specifikus transzplantációs antigének A T SEJTEK A SAJÁT MHC ALLOTÍPUSOK JELENLÉTÉBEN NEVELŐDNEK A NEM SAJÁT, IDEGEN MHC ALLOTÍPUSOKAT A T LIMFOCITÁK IDEGENKÉNT ISMERIK FEL A NEM KOMPATIBILIS SZÖVET KILÖKŐDÉSÉT ELSŐSORBAN A T SEJTES IMMUNVÁLASZ VÁLTJA KI AZ NK SEJTEK ÉS AZ ELLENANYAGOK ÁLTAL KÖZVETÍTETT EFFEKTOR FUNKCIÓK IS RÉSZT VESZNEK A KILÖKŐDÉSI REAKCIÓBAN TRANSZPLANTÁCIÓS IMMUNOLÓGIA

21

22 Most organs contain resident APCs such as dendritic cells. Transplantation of these organs into an allogeneic recipient provides APCs that express donor MHC molecules as well as costimulators. organ transplantation is associated with ischemic damage Host dendritic cells from the recipient may also migrate into the graft, pick up graft alloantigens, MHC mellett más polimorf gének is.. Many of the T cells that respond to an allogeneic MHC molecule, even on first exposure, are memory T cells.

23

24 A hiperakut kilökődést az előzetesen jelenlévő ellenanyagok grafthoz való kötődése okozza Vércsoport ellenes donor ellenanyagok Érfali endotéliumhoz kötődve gyulladást, érelzáródást okoz Graft elszíneződés, bevérzés

25 HIPERAKUT KILÖKŐDÉS – első órák –Xenograft vagy AB0 inkompatibilis graft esetén –Természetes szénhidrát specifikus IgM ellenanyagok Gal-α1-3Gal a xenograft endothel sejtjein –Ellenanyagok, amelyek előzetes vérátömlesztés, terhesség vagy transzplantáció során képződtek – anti-MHC –Komplement és véralvadási rendszer –NK sejt – közvetítette IgG-függő ADCC –Nekrotikus szövet károsodás KORAI AKUT REAKCIÓ – 2 – 5 nap –A citotoxikus T limfociták előzetes szenzitizálódása esetén - memória –IgG-közcetítette ADCC –Nekrotikus szövet károsodás KÉSŐI AKUT ÉS KRÓNIKUS REAKCIÓ – 7 – 21 nap –Th1 – mediált sejtes immunválasz –Késői túlérzékenységi reakció - DTH Fibrozis Sima izomsejtek proliferációja Atherosclerosis –Citotoxikus T limfociták aktivációja A SZÖVET KILÖKŐDÉS MECHANIZMUSAI

26 Acute rejection is a process of injury to the graft parenchyma and blood vessels mediated by alloreactive T cells and antibodies.

27 Krónikus kilökődés – hónapok alatt A transplantált szövet erei ellen irányul Érfal vastagodáshoz és a lumen szűküléséhez vezet E: endotél EL: elastikus lamina SMC: sima izom M: makrofág G: granulocita T: alloreactív T

28 A recipiens immun rendszerét gátolják – γ-besugárzás, gyógyszeres –Nincs kilökődási reakció, HVG A donor csontvelői érett T limfocitái felismerik a befogadó szervezet szöveteit –Graft versus host reakció, GVH – minden szövet ellen –Akut autoimmun reakció, végzetes lehet –Az érett T limfociták eltávolítása megakadályozza a GVH reakciót –Methotrexate és cyclosporin A gátolja a GVHD –Az érett T limfociták eltávolítása kedvezőtlenül hat a graft megtapadására és gátolja a leukémia ellenes hatást valamint fokozza a kilökődési reakció elindulását A CSONTVELŐ ÁTÜLTETÉS A TRANSZPLANTÁCIÓ KÜLÖNLEGES ESETE A donor hematopoietikus és immunrendszerét ültetik át a befogadó szervezetbe

29 Kórokozók menekülési útjai

30 influenza

31 Szokatlan hatása van az influenzának A WHO szerint kivételes az új madárinfluenza Mutálódik az új madárinfluenza-vírus, a H7N9

32 Influenza vírus mutációk gyakorisága/ fehérje antigén-drift

33 Influenzavírus okozta járványok H - hemagglutinin N - neuraminidáz Szerológiai módszerrel azonosítható altípusok: H0N1, H1N1, H2N2 etc. Általában egyidejűleg egy adott influenza vírus típus fertőz világszerte, amely ellen fokozatosan védelem alakul ki. A fertőzésre képes gazdaszervezetek száma tehát csökken, így a vírus „önvédelemből”, fennmaradása érdekében megváltoztatja antigén-szerkezetét.

34 Az immunválasz lehetséges lépései a mutációkra: II. TCR, BCR variencia

35 Antigén-drift Antigén-shift humán sertés Mechanizmusok az influenza-vírus felszíni antigén- variációinak kialakulására a.) Antigén-drift: pontmutációk felhalmozódása következtében olyan fehérjék jelennek meg, amit már nem ismer fel a korábbi változat ellen termelődött ellenanyag b.) Antigén-shift: ha humán és állati eredetű (pl. ember, sertés), virionok ugyanazt a sejtet fertőzik meg ssRNS-eik „keverednek”, új antigén jelenik meg – sokkal fertőzőképesebb vírus - pandémiát okozhat (ritkább)

36

37 Antigén-shift

38 A neutralizáló ellenanyagoknak a hemagglutininhez való kötődése megakadályozza, hogy a P személy fertőzötté váljon Q egyén fertőződése során a vírus mutálódik (V*), és megváltozott szerkezetű hemagglutinin képződik A V vírus elleni neutralizáló ellenanyagok P személyben nem tudják kivédeni a V* vírus által okozott fertőzést

39 RNS-vírusok (kis méret, gyors mutáció) – antigénvariánsok létrehozása DNS-vírusok (nagy méret) – elkerülik vagy módosítják az immunrenszer működését Citotoxikus sejtek elkerülése (antigén prezentáció csökkentése– NK sejtek gátlása) A fertőzött sejtek halálának gátlása.

40 1.Proteoszóma rezisztens szekvenciák (EBV) Immundomináns peptid epitópok képződésének gátlása pl. foszforilációval (HCMV) 2.A TAP fehérjék általi peptid transzlokáció gátlása a TAP fehérjéhez kapcsolódva (HSV citoszól felől, HCMV ER felől) 2c Az ER-ban az MHCI-hez kötődve gátolják annak peptid kötését, (HCMV) illetveaz ER-ban tartják (MCMV) 3.Az MHCI citoplazmatikus transzlokációját, proteoszomás degadációját segítik elő. (HIV-1, MHV68) 4.Az MHCI Golgiban tartása (MCMV) 5.Az MHCt a sejtfelszínről, iletve a Golgiból a lizoszóma rendszerbe irányítják. (HIV, KSHV) 6.A sejtfelszínen az MHC-hoz kapcsolódva gátolja annak kötődésést a CTL sejtekhez. (MCMV) Koreceptorok gátlása. HCMV humán citomegalovírus MCMV murin HSV herpes simplex vírus EBV Epstein-Barr vírus KSHV Kaposi szarkóma herpesz vírus Az antigén prezentáció gátlása

41 Az apoptózis gátlása I Sejthalál receptorok gátlása: szolubilis, kompetáló receptorok expressziójának indukálásával, a sejthalál receptorok lebomlásának előidézésével. A sejthalált elindító kaszpáz-8 aktivitásának gátlásával, kompetició, illetve közvetlen gátlás útján. Az anti-apoptotikus szignálok stimulálásával.

42 Az apoptózis gátlása II P53 tumor szupresszor gátlása, Bcl2 család pro-apoptotikus tagjainak gátlása, kaszpázok gátlása

43 Virális MHCI homológok A HLA-C és HLA-E arányának emelése a HLA-A és HLA-B kárára, amelyek a CD94, KIR receptorokon keresztül gátolják az NK sejteket, de nem/kevésbé vesznek részt az antigénprezentációban. Az NK sejteket aktiváló citokinek gátlása citokin kötő fehérjék előállításával, illetve Az NK sejteket aktivációját gátló citokinek stimulálása, vagy homológok előállítása. Az NK sejtek közvetlen megfertőzése Az NK sejtek gátlása

44 HCV az immunválasz elkerülésének és modulációjának stratégiája E2 glikoprotein antigén-variáció (EA nem ismeri fel) CD8 + T-sejt epitóp-mutáció (gátolja a T-sejt felismerést) - HCV core-fehérje (C) a T-sejt gC1qR komplement-receptorhoz kötődve gátolja a T- sejt funkciót - csökkent citokin-termelés (DC, Mf), - E2-CD81 kölcsönhatás gátolja az NK-funkciót B- és T-sejt felismerés gátlása HCV géntermékek modulálják az immunsejtek funkcióját: Egy vírus több lépcsőben is gátolhat:

45 HIV-1 Nef fehérjéjének hatása az immunválaszra Egy vírus partikulum több lépcsőben is gátolhat: Az MHCI mennyiségénel csökkentése a sejtfelszínen (HLA-C. HLA-E szint változatlan) A sejten kívüli Nef fokozza az MHCII expressziót, (CD4+ sejtek fertőzésést elősegítve) Endogén Nef gátolja az antigén prezentációt. (éretlen MHCII megjelenését serkenti) Exogén Nef fokozza kostimulátorok megjelenését (CD80, CD86) Endogén csökkenti Exogén Nef fokozza CXCR4 kemokin receptor expressziót éretlen dendritikus sejteken, ezáltal a T-sejtes zónában irányítva azokat Elősegíti a DC-T-sejt között kialakuló immunszinapszist Fokozza DC-k IL-termelését, folymatos T-sejt aktivációt indukálva FasL expressziót fokoz a fertőzött sejteken. (a citotoxikus sejteken ezáltal apoptózist indukál) Ugyanakkor védi a fertőzőtt sejtet az apotózistól. (ASK-1 gátláson keresztül) Csökkenti az izotípus váltást (CD40L mennyiségének csökkentése)... (Érinett jelátviteli molekulák Vav, Rac1, PAK2, ARF6, STAT3, NFkB, Bad)

46 Antigén variáció baktériumokban Salmonella typhimurium rendszeresen változtatja felszíni flagellin fehérjéjét, ami leállítja annak expresszióját. Ez lehetővé teszi egy másik gén kifejeződését, így egy eltérő antigén szerkezetű fehérje képződését. A Neisseria gonorrhoeae több variábilis antigénnel rendelkezik. Ilyen a pilin fehérje, melyet számos variábilis gén kódol, de közülük egy adott időben csak egy aktív. A csendes változatok időnként helyettesítik az aktívat.

47 Antigén variáció (mutáció) főként extracelluláris patogénekre jellemző (felületi struktúráik ellen képződnek ellenanyagok) Az antigén-variáció útjai: Szerotípus-specifikus immunitás – a patogén eltérő antigéntípusai miatt (pl. a Streptococcus pneumoniae 84 típusa ismert, poliszaccharid tokjuk eltérő); 1. típus2. típus4. típusn. típus Y Y 3. típus Y Y Y ……….

48 - Gram-negatív baktériumok: - a sejtfal poliszacharid lipid A oldallánca gátolja a MAC által történő lízist, - baktériumok sziálsav-oldalláncok, ill. SCR-tartalmú fehérjék kifejezése révén gátolja a komplementrendszer aktiválódását - némelyek rezisztensek a lizoszómális emésztőenzimekkel szemben, - Gram-pozitív baktériumok: Pneumococcus: poliszacharid a sejtfalban, sejthez kötődést gátolja. Streptococcus pyogenes felszínén: M-protein a fagocitózist gátolja. Staphylococcus-fajok: koaguláz enzim hatására a baktérium körül fibrin-burok alakul ki, ez gátolja a fagocitózist a védelem "kijátszása": Extracelluláris baktériumok

49 Intracelluláris kórokozók Ellenállnak a fagocitózisnak Mycobacteriumok gátolják a fagolizoszóma képződését M. leprae glikolipidje semlegesíti a reaktív oxigéngyököket Lysteria monocytogenes hemolizinje lehetővé teszi a patogén citoplazmába „menekülését” Fagocitózis/lebontás sok lépésből álló--- gátolható folyamat

50 A fagociták elleni védekezés Kapszula formálás, toxinok Programozott sejthalál indukálása. A baktérium felvétlének megakadályozása. (2-3) Az endoszómából a citoszolba ‘menekülés’ Az endoszóma érésének gátlása Lokális gátlások kialakitása, (pl. NO válasz) Pl. Salmonella SipB fehérjéje a kaszpáz 1-et gátolja Yersina enterocolitica a Rho család fehérjéinek szabályozásán kereztül a citoszkeleton átrendeződést gátolja. Listeria monocytogenes toxinja a listeriolysin tönkreteszi az endoszóma membránt. Salmonella az endoszómák mozgását irányítja

51 Az adaptív immunválasz gátlása 1.Immunszupresszív citokinek termelésének stimulálása. 2.Inflammatorikus citokinek termelődésének megakadályozása 3.Az APC-k baktérium felvételének megakadályozása. 4.A fagoszómák érésének, 5.Az antigén hasításának szabályozása. 6.Az MHCI, II mennyiségének csökkentése. 7.A T és B-sejt receptorok jelátvitelének gátlása, 8.Vagy gátló receptorok aktiválása. 9.Szupresszor T-sejtek aktiválása. 10.Apoptózis indukálás. Mycobacterium fertőzött makrofágok IL-6, IL10, TGF-  -t termelnek. Yersinaenteocolitica YopP fehérjéje az NF  B és a MAPK útvonlak gátlásával a gyulladási citokinek termelését megakadályozza. H. pylori az internalizált antigének degradációját gátolja, FasL expressziót fokoz. Yersina pseudotubercolosis YopH triozn foszforilációt gátol….

52 Paraziták A föld népességének kb. 30%-a

53 Többsejtű paraziták ellen kialakuló immunreakciók Shistosoma mansoni (bilharzia)

54 Afrikai tripanoszómákban a változások a fertőzött egyénben zajlanak le. A tripanoszómát borító glikoprotein (VSG – variant-specific glycoprotein) ellen hatékony immunválasz indul meg. A patogén genomjában azonban 1000 VSG van, melyek mindegyike eltérő szerkezetű antigént kódol. Közülük egyszerre csak egy jelenik meg a felszínen. Programozott DNS átrendeződés a patogénben

55 Trypanosoma antigén-shift által okozott parazitémia-hullámok Minden variánst (variant 1, 2, 3 etc.) más-más ellenanyag ismer fel -nincs keresztreakció (ezért a V1 ellen pl. hatástalan a V2-spec. ea) Az antigén-shift génszegment-duplikációk eredménye. A különböző VSG-t (Variant Surface Glycoprotein) kódoló szakaszok az expressziós helyre kerülnek (transzlokációval) – megváltozik a kórokozó antigenitása.

56 - antigenitásuk elenyésző - számos protozoon az immunrendszer elől elzárt helyen telepszik meg - pl. a malária-parazita és a Toxoplasma - a sejteken belül élősködik - számos parazita - pl. a bélben élősködő Entamoeba, a vékonybélbenélősködő hengerféreg, a Trichinella az immunrendszer működésének ellenálló cisztákat formál - "antigen masking" - a paraziták felszínüket a gazdaszervezet fehérjéivel "vonják be" pl. Schistosoma mansoni. -"molekuláris mimikri" a komplementrendszer kaszkádját gátló fehérjék (pl.DAF) szerkezetével analóg molekulák termelése (pl.Trypanosoma cruzi) - "antigén shift – a parazita-felszíni glikoprotein változik - ellenálló burkot alakítanak ki (pl.Schistosoma lárva) - a fagoszóma és a lizoszóma fúziójának gátlása (pl. Toxoplasma gondii) - a fagoszóma membránját oldja, és így jut a citoplazmába (pl. Trypanosoma c.) a védelem "kijátszása": Paraziták Stratégia: ne váltsanak ki immunreakciót

57 A fagociták kompartmentjeinek átrendezése Trypanosoma cruzi, kimenekül a citoplazmába, pórusképző fehérjék termelésével. Toxoplazma gondii, a vakuóla membrán fehérjéit ‘kicseréli’ saját fehérjékre, ezzel gátolja a lizoszómák érését. Leishmania, receptor mediált endocitózissal jut be, majd LPG fehérjéje beépül a vakuóla membránba, ahol gátolja annak érését

58 A makrofágok jelátviteli útvonalainak gátlása Malária, Leishmania gátolja a PKC aktivációt, ezáltal a oxidációs egyensúlyt. Leishmania, gátolja az az INF függő IL12 termelést a celuláris SHP-1 foszfatáz aktiválásával. Toxoplazma, gátolja a citokin választ az NFkB nukleáris transzlokációjának megakadályozásával, illetve a STAT1 defoszforilálásával.

59 Korokozóktól független immunszupresszív állapotok: Sok esetben hasonló mechanizmusokkal történik. (citokinek aktivációja/gátlása, apoptózis indukció, NK sejt aktivitás gátlása...


Letölteni ppt "MONOCLONAL ANTIBODIES versus POLYCLONAL ANTIBODIES."

Hasonló előadás


Google Hirdetések