Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése."— Előadás másolata:

1 Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése

2 Az eukarióta gének csoportjai I.-5.8S, 18S, 28S rRNS III.-5S rRNS, tRNS II.-fehérjék

3 TFIIH TFIIA A transzkripciós iniciációs komplex kialakulása TATA TBP POLII TFIIF TFIIB TIP120 TFIIE

4 A TIP120 fehérje néhány jellemzője 1230 AS, szimpla polipeptid Affinitást mutat a TBP-vel és az RNS Pol II Rpb5 alegységével Az iniciációs komplex összeszerelődését serkenti A funkció betöltésében fontos a molekula N-terminális 1/3-a A TIP120 fehérjét kódoló gént kimutatták patkányban, Coenorhabditisban, Drosophilában, emberben, Arabidopsisban

5 Inszerciós mutagenezis Növényi gén exon/intron promóter 5' UTR3' UTR T-DNS LBRB T-DNS inszerció Funkcióvesztéses mutáció Funkcióvesztéses mutáció

6 A H911 vonalban azonosított mutáns Columbia: normál fenotípus H911/4: apró fenotípus

7 A H911 mutáns virágja Columbia: Normál fenotípus H911/4: Majdnem teljesen steril

8 T-DNS inszerció pozíciója a H911 vonalban Protein: feltételezett TBP kölcsönható fehérje (120 kD) (TBP Interacting Protein, TIP120) T-DNS inszerció: 13. exon (3301bp) Gén: At2g02560 RL 2. Krom., BAC T8K22

9 Lokalizáció: 2. kromoszóma, AT2G02560 jelű lókusz Exon-intron szerkezet: 28 exon Az Arabidopsis tip120 gén

10 A H911 vonal szegregációs analízise LB primer T-DNS H911AH911B 5’3’ PCR primerekvad típus heterozigóta homozigóta H911A+B+ + - H911B+LB bp 1000bp 750bp 1500bp 1000bp 750bp 800bp, H911A+H911B 600bp, LB1+H911B Alvonal: Fenotípus: n n n n n n n n a a Genotípus: +/+ +/+ +/- +/- +/- +/- +/- +/+ -/- -/- PCR analízis eredménye

11 A tip120 gén expressziójának vizsgálata 1. Northern analízis: vad típusú Arabidopsis, illetve apró fenotípusú mutáns totál RNS felhasználásával: nincs detektálható jel. 2. Realtime RT-PCR analízis: tip120 CT értéke: actin kontrol CT értéke:15.61 tip120 gén expressziós szintje 32x alacsonyabb az actin gén expressziós szintjénél.

12 A TIP120 fehérjét kódoló teljes hosszúságú cDNS klónozása TIP2 ATGSTOP TIP1 PCR-amplifikálás (ELONGASE enzim, Invitrogen) BamHI- klónozás pBLUESCRIPT vektorba cDNS- klón: 3990 bp pBS SK+ A cDNS szekvenálásának stratégiája TIP1H911A TIP3 TIP4 TIP5TIP6TIP2 BamHI

13 A tip120 cDNS-klón vázlatos térképe 5’ 3’ BamHISacI EcoRIBamHI ESTT17 ATGSTOP A tip120 cDNS további klónozása: pAS2 kéthibrid vektor pPCVB1 expressziós vektor

14 Összefoglalás - a H911 mutáns előállítása T-DNS inszerciós mutagenezissel - az apró fenotípust a tip120 génben bekövetkezett homozigóta inszerció okozza - a tip120 expressziója alacsony szintű -a tip120 cDNS klónozása pBS, pPCVB1 növényi expressziós vektorba -élesztő-kéthibrid rendszer kidolgozása folyamatban van

15 Köszönetnyilvánítás -Dr. Szabados László -Dr. Kovács Izabella -Dr. Martha Alvarado -Dr. Ökrész László -Zsigmond Laura -Ábrahám Edit -Bíró Anikó -Dr. Maróy Péter -Dr. Boros Imre


Letölteni ppt "Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése."

Hasonló előadás


Google Hirdetések