Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Immunrendszer sejtjeinek jellemzése és elválasztása Áramlási citometria, FACS poliklonális limfocita aktiválás.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Immunrendszer sejtjeinek jellemzése és elválasztása Áramlási citometria, FACS poliklonális limfocita aktiválás."— Előadás másolata:

1 Immunrendszer sejtjeinek jellemzése és elválasztása Áramlási citometria, FACS poliklonális limfocita aktiválás

2 Figyelmeztetés A diasorozat „bő lére van eresztve”. Az ábrák jelentős része (pl. sok áramlási citometriával kacsolatos dia) nem része a „törzsanyagnak” csak érdekességként, háttérinformációként szolgál!

3 Az immunrendszer sok sejttípusa (pl. a különféle limfociták) morfológiailag nem megkülönböztethetők egymástól

4 HUMÁN LIMFOCITAPOPULÁCIÓK FONTOSABB SEJTFELSZÍNI STRUKTÚRÁI

5 Az immunrendszer sejtjeinek jellemzése sejtfelszíni antigének* alapján A sejtfelszíni markerek alapján jellemezhető a sejtek funkcionális állapota is (nyugvó/aktivált) és diagnosztikus értéke is lehet  a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása,  rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése,  egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése esetén. Példák:  „Aktiválási markerek” megjelenése (CD69 (limfociták), CD83 (DC))  haematológia neoplasticus folyamatok diagnosztikája, csontvelői érési zavarok  HIV progresszió/AIDS manifesztációja: CD4+ helper T sejtek számának csökkenése (CD4+ : CD8+ = 1.6, Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/  l) AIDS = CD4+ T sejt szám <200/  l!  CD5+ B sejtek felszaporodása – B sejtes leukémiák egy része (* az immuniológusok gyakran az immunválasz szemszögéből viszonyulnak különféle anyagokhoz, ezért gyakran megesik, hogy ott ahol mások a „molekula”, „receptor” vagy „fehérje” kifejezéseket használnák ott az „antigén” szót találjuk. Mivel ezeket az anyagokat gyakran ellenanyagok segítségével fedezték fel/mutatják ki, a terminus használata helyénvaló)

6 CD antigénsejttípusfunkcióligand CD3T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper T sejtek, plazmacitoid dend- ritikus sejtek (pDC), monociták T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC-II, HIV CD5T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejtek) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19B sejtek CR2 része, B sejt antigénreceptor koreceptora C3d, C3b CD28T sejtek kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34hematopoietikus progenitor sejt, endotélium sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152

7 Eredményt jellemzi: tisztaság és kinyerés (avagy visszanyerés) hatékonysága Cél: a számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból. Elvi alap: a sejtek valamely a többitől eltérő tulajdonságát kihasználva történik a szétválasztás (amennyiben ez a különbség kihasználható!) fizikai – sűrűség, méret sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre immunológiai – eltérő sejtfelszíni antigének Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása Kétféle megközelítés: pozitív szeparáció – a kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől negatív szeparáció – a nemkívánatos sejtek megjelölése & eltávolítása (depléció)

8 Ficoll-Paque/Percoll sűrűség alapú sejtszeparáció perifériás vér vékony pipettával a sejtek alá töltött Ficoll centrifugálás szeparált, tisztított sejtek plazma ficoll vvt-k mononukleáris sejtek (MNS, PBMC) vérlemezkék granulociták mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása

9 (Nature Protocols (from Google pictures)

10 Rozetta képzést felhasználva a Ficoll szeparáció felhasználható a nem kívánatos sejtek eltávolításához is, melyeket vvt-hez kötünk (RosetteSep ™, StemCell Technologies)

11 Az adherens sejtek kinyerése vagy eltávolítása Olcsó, egyszerű, de csak az adherens sejtek elválasztására alkalmas, és alacsony tisztaságú

12 Ellenanyag ”panning” kitapasztott ellenanyagok

13 Komplement mediált lízis ellenanyagok komplement LÍZIS A vörösvérsejtek enyhén hipotóniás ammónium-klorid pufferben lizálhatóak, ellenanyag és komplement nélkül is!

14 Mágneses sejtszeparálás (MACS 1.) paramágneses gyöngy („bead”) specifikus ellenanyag Egyszerű mágneses sejtszeparálás Fagocita sejtek apró vasszemcséket képesek fagocitálni, ezután egy erős mágnessel elválaszthatóak más sejtektől

15 MACS 2. AZ ELVE HASONLÓ AZ IMMUNSZORBENS TECHNIKÁHOZ

16 Mágneses sejtszeparálás (MACS 3.) MÁGNES oszlop Nem jelölt sejtek kinyerése (negatív szeparáció), vagy eltávolítása (depléció) jelölt sejtek kinyerése (pozitív szeparáció)

17 Áramlási/áramlásos citometria Az immunofluoreszcens módszerek közé tartozik, a felhasználás lehetőségek jelentős része a monoklonális technikán alapul. Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas FELHASZNÁLÁS: A klinikumban immunológiai és haematológiai diagnosztika, kis százalékban jelenlevő sejtek vizsgálata. A kutatásban széleskörű felhasználás a sejtek életképességének mérésétől a kromószamaanalízisen át a sejtelválasztásig. Folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket vizsgál A fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja Morfológiai adatokat csak közvetetten szolgáltat (méret, granuláltsági állapot) Statisztikai jellegű módszer

18 Fluoreszcein, FITC (fluoreszcein izotiocianát) fluoreszcein-5-izotiocianát Fluoreszcens jelzőanyagok 1. Sok izomer létezik, ezek fény intenzitása kissé eltér egymástól!

19 Fikoeritrin, PE 3Z-fikoeritrobilin (PEB) kromofór csoport Fluoreszcens jelzőanyagok 2. A fikoeritrin különféle algák fotoszintetikus apparátusában a klorofill ”alá dolgozó” fehérje

20 Kívánalmak a festékekkel szemben -minél nehezebben kioltható fluoreszcencia (fotostabilitás) -minél szűkebb excitációs és emissziós spektrum (több „szín” együttes használhatósága miatt) Új generációs festékek →Előnyös kioltási és spektrális tulajdonságok →„egzotikus” spektrális tartományok használata: UV (Pacific Blue ® ), infravörös - IR (PE-Cy7, APC-Cy7) →Tandem festékek: energiaátadás a két komponens között, nagy eltérés lehet az excitációs és emissziós spektrum között (akár extrém „Stokes- shift”-ek is, pl. PE-Cy7) →Jellemzőbb képviselők: APC, AlexaFluor ® család, Dyomics DY-xxx, Pacific Blue ®, TexasRed ®, PE-TexasRed ® →Tandemek: BD Cy-chrome ® (=PE-Cy5), PE-Cy7, Cy5.5-PerCP, APC-Cy7 Fluoreszcens jelzőanyagok 3.

21 ©J.Paul Robinson A citométerek fejlődése a korai sejtszámláló berendezésektől a sejtválogató „szorterekig” Early cell counter. Katherine Williams and C.S. Sanders (Atomic Energy Research Establishment) Unclassified in (Photo taken in Science Museum, London UK)

22 asztali áramlási citométer (BD FACSCalibur ™ ) szorter-áramlási citométer (FACS, BD FACSDiVa ™ )

23 a: eritrociták a lamináris folyadékáramban egyenletesen rendeződve és kissé elnyúlva haladnak a hirodinamikai erők hatására a központi áramlat mentén b: turbulens áramlásban a sejtek deformálódnak és a cső fala mentén szétszórtan, különböző sebességgel haladnak a folyadékárammal (v>3 m/s) Image fromV. Kachel, et al. A lamináris áramlás lehetővé teszi a sejtek gyors vizsgálatát

24 Lamináris áramlásban a tinta vékony sugárba rendeződve áramlik az elvezető csövön keresztül (hidrodinamikai fókuszálás) A tinta elvezető-csőbeli elhelyezkedését alig befolyásolja az eredeti pozíciója V. Kachel, H. Fellner-Feldegg & E. Menke

25 A citométer hidrodinamikai rendszere Injektor Fluoreszcens szignálok Fókuszált lézer sugár vivő folyadék akár 6-10m/s sebesség minta vivő- vagy köppeny folyadék Áramlási cella

26 A mért paraméterek: Fényszórás (FSC, SSC) FALS Sensor FSC (forward angle light scatter, forward scatter) 90LS Sensor SSC (side scatter) Lézer Előre irányuló fényszórás 90  -os (oldal) fényszórás kisebb struktúrákról (organellumok, sejtfelszín) bármely részecskéről (”sejtméret”)

27 Lézer A mért paraméterek: Fluoreszcencia FALS Sensor FSC nagy érzékenységű fotodetektorok (fotoelektron sokszorozók – PMT photon multiplayer tubes ) fluoreszcens festékek vagy autofluoreszcencia (piridinek és flavinok jelenléte miatt)

28 Az áramlási és az optikai rendszer elvi felépítése PMT 1 PMT 2 PMT 4 spec. tükrök és fényszűrők Lézer(ek) PMT 3 vizsgálandó sejtek fényérzékelők áramlási cella FSC érzékelő

29 B A jelölés az elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul NK Th TcImmunfenotipizálás Pl.: a CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T sejtek arányának Meghatározása perifériás vérben Jelölő anyagok: FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC) PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE) A perifériás vérben jelenlévő limfociták egy részéhez specifikusan kötődik a megfelelő ellenanyag

30 Fókuszált lézernyaláb Th nagy sebességű folyadékáram (küvettában, vagy szabadon) CD4 FITC CD8 PE detektor A FITC jelölt (T H ) sejt detektálása (CD4-FITC) jelfeldolgozó egység Képernyő A CD4+ CD8- sejtet szimbolizáló pont

31 Tc detektor A PE jelölt (T c ) sejt detektálása (CD8-PE) CD8 PE CD4 FITC jelfeldolgozó egység

32 B detektor A jelöletlen sejtek detektálása (pl.B) CD8 PE CD4 FITC jelfeldolgozó egység

33 kvadráns statisztika CD8 PE CD4 FITC 38% 0% 44% 18%

34 Ábrázolásmódok 1. dot-plot contour- plot density- plot („pseudocolor”)

35 Ábrázolásmódok 2. - Ábrázolásmódok 2. - Hisztogram

36 A különböző sejttípusoknak jellegzetes fényszórásuk van előre irányuló fényszórás - FSC („méret”) oldal irányú fényszórás - SSC (granuláltság, a sejtek komplexitása) granulociták monociták limfociták

37 A vérminta vörösvérsejt mentesítéséhez használt módszer befolyásolja a megmaradó sejtek százalékos összetételét az eritrociták lizálásával kapott eredmény sűrűség alapú elválasztással kapott eredmény (Ficoll) hiányzó granulociták

38 összes sejt granulociták monociták limfociták A ”kapuzás” segítségével az egyes populációk külön-külön jellemezhetők (gating) granulocita „kapu” monocita „kapu” limfocita „kapu”

39 Az előző ábrával kapcsolatban felmerülhet, hogy honnan lehet megállapítani, hogy egy adott sejt valóban specifikusan jelölődött-e vagy az autofluoreszcencia miatt látszik jelöltnek? A CD4 jelölés a limfociták esetében egyértelmű volt a helyzet, mert a + és – populáció egyszerre volt jelen, és a CD4+ limfociták könnyen elkülöníthetőek a CD4- limfocitáktól. De vannak problémás esetek is! Pl. CD1a, MHC szerű molekulát expresszáló dendritikus sejtek arányának meghatározása Honnan számítanak a sejtek pozitívnak?

40 ? Összehasonlítás egy festetlen kontrol mintával (vagy izotípus kontrol ellenanyaggal „jelölt”) Hol húzzuk meg a határt? humán CD1a specifikus, egér IgG1 „kontrol” egér IgG1 ellenanyag (pl. DNP specifikus)

41 Együtt ábrázolva a specifikus festődést egy más hullámhosszon mért autofluoreszcenciával: autofloureszcencia IgG1 izotípus kontroll ellenagyag CD1a autofluoreszcencia A hisztogrammos ábrázolásmód sok esetben megtévesztő lehet A hisztogramm elfedi ezeket a sejteket Az izotípus kontroll ellenanyaggal „jelölt” minta segítségével kijelölhető a várt CD1a+ sejtek helye

42 Például: NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) NK sejtek NKT sejtek limfociták Szorter-áramlási citométerrel (FACS) elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető

43 Az áramlási cellát rezegtetve a folyadéksugár cseppekre bontható (bennük a sejtekkel) töréspont (4-5 cseppenként 1 sejt)

44 Lézer vibráló áramlási cella Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra arra az időre elektromos töltés kapcsolódik, így a leváló csepp töltötté válik. Elektromosan töltött eltérítő lemezek Gyűjtőcső A folyadéksugár cseppekre szakad

45 A sejtek nukleinsav mennyisége kimutatható a nukleinsavakhoz sztöhio- metrikus mennyiségben kötődő festékekkel. Ilyen, a duplaszálú nuklein- savakba (DNS v. RNS) interkalálódó festék: propidium jodid ethidium bromid N+N+ C2H2)3C2H2)3 NH 2 N+N+ C2H5C2H5 CH 3 C2H5C2H5 Propidium N+N+ C2H5C2H5 NH 2 Ethidium Sejtek fenotípusa mellett a sejtek állapota/funkciója is vizsgálható A sejt anyagcseréjének intenzitását jelezheti a benne levő mitokondriumok száma - ez a mitokondriumokat specifikusan festő anyagokkal kimutatható.

46 G2G2G2G2 M G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G2G2G2G2M DNA Analysis DNA content CountCount 2N 4N A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján

47 PI Fluorescence 2N 4N DNA Analysis szub G0/G1 sejtek A typical DNA Histogram

48 A sejtciklusra jellemző (intracelluláris) fehérjék megjelenésének a kimutatásával (ellenanyagokkal) további lehetőségek nyílnak a sejtciklus, és az osztódó sejtek kimutatására: Ciklinek, Ki-67, PCNA Apoptózis kimutatása: DNS mennyiség csökkenése alapján Nukleoszómák közötti DNS hasítás során keletkező DNS végek jelölése: BrDU avagy dUTP és Tdt (terminális deoxinukleotidil transzferáz) A sejtmembrán normális esetben intracelluláris oldalán levő foszfatidil szerin molekulái megjelennek az extracelluláris oldalon. Fluoreszceinnel konjugált Annexin V jelölés normál sejtciklusú sejtek szub G 0 /G 1 sejtek

49 Kromoszóma Analízis és szeparálás Kromoszómák is analizálhatóak és izolálhatóak áramlási citométerrel megfelelő kezelés után. Elterjedt módszer két különböző DNS festék használata: a Hoechst 33258, amely AT-gazdag régiókhoz, és a chromomycin A3, amely GC-gazdag régiókhoz kötve a kromoszómák jellegzetes festődését okozza. Alapja: a kromoszómák eltérő AT/GC aránya Kromoszóma szeparálás pl. genomikai vizsgálatokhoz lehet hasznos (kromoszóma specifikus pool-ok létrehozása genom projecthez)

50 J.W. Gray & L.S. Cram Normal human Human X hamster Normal hamster Normal mouse Chromomycin A3 Hoechst 33258

51 Kinetikai mérések citométerrel Homogén sejtpopulációban az átáramló sejtek valamely tulajdonságának egymás utáni megmérése, annak időbeli változására enged következtetni Megfelelő indikátor használatával lehetséges az intracelluláris Ca 2+ szignál mérése áramlási citométer segítségével Ilyen a sejtbe „tölthető” fluoreszcens Ca 2+ indikátor festék a Fluo-3 vagy az Indo-1

52 Ca 2+ szignál mérése áramlási citométerrel Az intracelluláris Ca 2+ szinttel arányos fluoreszcencia idő alapjel a sejtek aktiválása pl. Fluo-3 vagy Indo-1

53 Ca 2+ szignál mérése áramlási citométerrel Influenza vírus hemagglutinin fehérje eredetű peptidre specifikus T sejt hibridóma Ca 2+ szignálja a peptidet bemutató antigén prezentáló sejt hatására. Aktiválatlan T sejtek A sejtek aktiválásával eltelő idő (az APC és T sejt összecentrifugálása) Aktiválódott T sejtek

54 Imaging cytometry, LSC….. (Részletesebb morfológiai információk) forrás: brosúra tükrözheti: sejtek differenciáltsága sejtosztódás vándorló sejtek

55

56

57 A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA/ionomicin jelenlétében B sejt T sejt BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák LPS a CD14+TLR4 komplexen keresztül aktiválja a sejteket A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. Az Ionomycin a külső Ca 2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA- val

58 Poliklonális B sejt aktivátorok hatásai AktivátorT sejt függésIg szekréció Humán B sejt PWM (pokeweed mitogen) nincsvan SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) nincsvan EBV (transzformáló hatású is) van Anti-Igvancitokinek jelenlétében Egér B sejt LPSnincsvan PWMvan PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) nincsvan Anti-Ignincscitokinek jelenlétében Poliklonális T sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA)lektinCanavalia ensiformis Concanavalin A (ConA)lektinPhaseolus vulgaris anti-CD3Monoklonális ellenanyag

59 Pokeweed (PWM) (Phytolacca americana) - Álkörmös Termését borszínezésre használták, aztán rájöttek, hogy mérgező (triterpénszaponin, és mitogén lektin) Mo.-n dísznövényként tartják Chenopodiales (libatopvirágúak) Phytolaccaceae (álkörmösfélék)

60 Phytohaemagglutinin (PHA)  Canavalia ensiformis – Jackbean, Sword bean - Kardbab

61 Concanavalin A (ConA)  Phaseolus vulgaris – (vetemény) bab


Letölteni ppt "Immunrendszer sejtjeinek jellemzése és elválasztása Áramlási citometria, FACS poliklonális limfocita aktiválás."

Hasonló előadás


Google Hirdetések