Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Áramlási citometria az orvosi diagnosztikában és gyógyszerkutatásban Dr. Milosevits Gergely.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Áramlási citometria az orvosi diagnosztikában és gyógyszerkutatásban Dr. Milosevits Gergely."— Előadás másolata:

1 Áramlási citometria az orvosi diagnosztikában és gyógyszerkutatásban Dr. Milosevits Gergely

2 Előadás vázlat 1.Definíció 2.Történeti áttekintés 3.A műszer alapvető felépítése 4.Mérhető paraméterek 5.Alkalmazási területek i.Orvosi diagnosztika  Mérések értékelése ii.Ipari felhasználás iii.Kutatás és gyógyszerfejlesztés

3 Mit jelent? Az áramlási citometria egy módszer,mely során…  folyadékban szuszpendált sejtek / részecskék áramolnak egyesével egy fényforrás előtt,  ami alapján azok fizikai és / vagy kémiai tulajdonságaira következtethetünk a generált jelek detektálásával és elemzésével.

4 Az áramlási „partikulometria” kezdetei: 50-es évek Elmqvist / Sweet tintasugaras nyomtató: tintacseppek áramoltatása, számlálása Wallace H. Coulter ( ) Coulter számláló: sejtek analízise áramló folyadékban „Vérkép”-elemzés

5 Az citometria fejlődése: Becton & Dickinson: FACScan Herzenberg : - szorter funkcióval ellátott flow cytometer (1975) - FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter

6 Legújabb típusú készülékek: BD Accuri BD FACSVerse -Több lézer, detektálási hullámhosszsáv -Hordozható -„Megfizethető” ár: 12m Ft -Összes elérhető laser-t tartalmazza -Teljesen automatizált működés -96 well plate mintaadagoló

7 Alapvető felépítés 1)Áramlási kör: a)Tartályok b)Csőrendszer c)Filterek d)Áramló köpenyfolyadék: PBS 2)Fényforrás: Argon (488nm) laser / He- Ne (635nm) laser / He- Cd (325nm) laser/ UV 3)Detektorrendszer 4)Analóg-Digitális átalakító 5)Számítógép + Software

8 Mérhető paraméterek Fluoreszcencia: =laser által gerjesztett fény, melyet fluoreszcens festékek által jelzett részecskék emittálnak Side scatter (SSC) ≈partikulum granularitás Forward scatter (FSC) ≈partikulum méret

9 Detektálási lehetőségek 1)Sejt / részecske: natív mérés  FSC, SSC 2)Felszíni antigének  Szekunder AT - Fluoreszcens festék 3)Antitestek, citokinek  Adszorbens gyöngy + szekunder AT- Fluoreszcens festék

10 Fluoreszcens festékek

11 Miért jó / nem jó? ELŐNYÖK Sok részecske gyors analizálása Sejt sub-típusok kvantitatív meghatározása Natív mérés: olcsó Egyszerre több paraméter mérése HÁTRÁNYOK Karbantarás: körülményes, drága Fluoreszcens festékek, AT-k drágák (pl. FITC kötött AT: e Ft / ml) Méretkorlát: 0,3 és 150 μm

12 Mire jó / nem jó? MÉRHETŐ Sejtek / 300nm feletti részecskék Hozzávetőleges méret, granuláltság Sejtfelszíni marker, DNS tartalom, ionáramlás, antitestek, citokinek (FL szek. AT és adszorbens gyöngyök közvetítésével) NEM MÉRHETŐ 300nm alatti vagy 150 μm feletti részecskék Pontos méret, szerkezeti felépítés Morfológia

13 Lehetséges alkalmazási terültek Orvosi diagnosztika Infektológia Immunológia / Allergológia Hematológia Onkológia Gógyszerkutatás Immunogenitás vizsgálata Gyógyszerhatás felmérése Szerkezeti analízis

14 Elérhető rutin-laboratóriumi vizsgálatok Vérkép CD4/CD8 sejtarány Th1/Th2 arány NK funkció, arány HLA-B27 meghatározás Immunglobulin szint meghatározás DNS tartalom és sejtproliferáció vizsgálata Bazofil aktivációs teszt Leukémia és limfóma „panel”-ek

15 DD.: Infektologia Teljes vérkép meghatározása - Kalibrált automata: - pl. Abbot Cell-Dyn Multi-Angle Polarized Scatter Separation 0° : sejtméret 10° : sejtszerkezet és komplexitás 90° polarizált: nukleáris lebenyezettség 90° depolarizált : eosinophilek differenciálása

16 DD.: Infektologia Fehérvérsejtszám: Fiziológiás: Neu: / µL Ly: /µL Bakeriális inf: Neu: ↑↑↑ Ly: - Virális infekció: Neu: - Ly: ↑↑↑

17 Immunologia SEJTCitotoxikus TTh1Th17TfhTregTh2Th9 Károsító hatás Transzplant. rejekció Autoimmun betegségekAllergia Felszíni markerek CD8CD4 CXR3CCR6CXR5CD25CCR4 CitokinekIFN-G, TNF TNF, IL17,- 21,-22, -26 IL 21TGF- B, IL 10 IL 4,- 5,-6,- 13 IL 9,-10 T-sejt meghatározás

18 Immunologia T-sejt meghatározás CD4CD8 CD3

19 Immunologia T-sejt meghatározás: CD4CD8 CD3 Citotoxikus TT helper

20 Immunologia Basophil aktivációs teszt: -Aktivációs marker: CD63 -pl. krónikus idiopátiás urticaria diagnózisa

21 Onkologia DNS tartalom analízis -Elmélet:  Tumoros sejtek DNS tartalma nagyobb  Nagyobb S és G2/M arány -Gyakorlat:  Sejt permeablitiásának fokozása  DNS tartalom festése: propidium jodid – fokozza a fluoreszcenciát!

22 Haematologia Leukaemiák és limfómák DD. Sejtfelszíni markerek alapján Utánkövetés: Minimális Reziduális Betegség (MRD) Retikulocytaszám meghatározás: Anaemia DD.

23 ALL VÉRKÉP: VVT ↓, THR ↓, FVS (↑/−/↓) ( + ↑ LDH, karbamid, sülly.; periférián blasztok, máj-, vesefunkc. eltérések ) Osztályozás.: Morfológia + genetika + immunologia! B-sejt: CD 10, 19, 20, 22 T-sejt: CD 2, 3, 5 Differenciálatlan: TdT; (HLA-DR; CD34) Gyors fenotipizálás citometriával!

24 B-sejtes Pre-pre-B: + :TdT; CD19, -34; HLA-DR Pre-B: + : TdT; CD19; cyIgM; (CD10) Burkitt-ALL: + : CD19; SIgM; κ/λ; (CD10) - : CD34; HLA-DR T-sejtes Korai T: + : TdT; CD7; cyCD3 - : CD1 Átmeneti- T: + : TdT; CD1, -7 érett-T: + : SCD3; CD7; (TdT) Differenciálatlan: +: TdT; (HLA-DR; CD34) ALL

25 AML VÉRKÉP: VVT ↓, THR ↓, FVS (↑/−/↓) Osztályozás.: Morfológia + genetika + immunologia! Myelocyta markerek: CD13, -33; cyMPO Monocyta markerek (M4,M5): CD14 Thrombocyta markerek (M7): CD41, -42, -61 Citometria! 2006-os Bethesda beosztás: CD7, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, CD45, CD56, CD117, HLA Dr

26 AML CD45 vs. SSC kapuzás: felismerhetők a myeloblastok

27 M0 / M1 / M2 AML (Myelocyta)

28 M3 AML (promyelocyta)

29 M4 / M5 AML (monocyta)

30 M6 AML (erythrocyta)

31 M7 AML (megakaryocyta) CD 42b CD 41

32 Ipari felhasználás 1.Ivóvízben, fürdővízben baktériumok gyors kimutatása Kalibrált automaták, gyors és olcsó analizálás Nagy mintaszám ellenőrzése 2.Borászatban megfelelő élesztőkoncentráció mérése 3.Tenyészállat nemzőképességének felmérése ivarsejtek számlálása DNS festés segítségével a viabilitás felmérése

33 Alkalmazás a kutatásban, gyógyszerfejlesztésben -Intracelluláris enzimek és ionok koncentrációjának mérése -Membránpotenciál mérése -DNS tartalom, sejtproliferáció, apoptózis vizsgálata -MDR mechanizmusának vizsgálata -Immunogenitás -Aggregációvizsgálat -In vivo és képalkotóval kombinált vizsgálatok

34 Ionkoncentrációk mérése -Indikátor alkalmazása: -sejtbe áramlik → hidrolizálódik → → nem jut át a sejtmembránon → intracellulárisan felhalmozódik -SBFI – Na+ -PBFI – K+ -FURA-2, INDO-1, Fluo-3 – Ca2+ -BCECF – pH

35 Membránpotenciál mérése -Oxanol  Membránpotenciálnak megfelelően oszlik meg a membrán két oldalán  Depolarizáció hatására nő az intracelluláris oxanol mennyisége → fluoreszcencia fokozódik

36 Gyógyszerkutatás: MDR vizsgálata Calcein -festék, amely intracellulárisan felhalmozódik -MDR pumpák a sejtből eltávolítják -Intracelluláris jelenlétével arányosan változik a sejt fluoreszcenciája

37 Gyógyszerkutatás Apoptózis vizsgálata Plazmamembrán változások: - ANNEXIN V szintje emelkedik - FITC konjugálva mérhető DNS fragmentáció - Propidium jodidos festés: - korai, késői apoptotikus sejtek és nekrotikus törmelék elkülönítése

38 Immunogenitás vizsgálata Poliklonális és specifikus monoklonális antitestek vizsgálata Kvantitatív meghatározás IgA, IgE, IgM, IgG szintek mérése Módszer: multi-bead array Gyöngyökhöz kötött antitesek vizsgálata szekunder, fluoreszcens antitestekkel

39 Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata -Szupravezikuláris struktúrák vizsgálata liposzómális oldatokban -Szabad-gyógyszer koncentráció hatásainak vizsgálata a liposzómális-gyógyszer stabilitására és aggregálódására

40 Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata PBS puffer (A), lejárat előtti Caelyx (B), lejárat utáni Caelyx (C)

41 Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata A: lejárat előtti Caelyx közvetlenül felbontás után B: lejárat utáni Caelyx C: lejárat előtti Caelyx nyitás után percekkel újra mérve

42 A jövő lehetőségei ZÁRT RENDSZEREK: Imaging flow cytometry Morfológiai anamnézist is lehetővé tesz: az áramló részecskékről képfelvétel készül NYÍLT RENDSZEREK: LSC: Laser scanning cytometry Tárgylemezen lévő sejtek analízise: morfológiai elemzés és fluoreszcencia rögzítése In vivo citometria Tumorsejtek intravasális nyomonkövetése

43 Összegzés Az áramlási citometria alkalmas sok részecske gyors és többparaméteres kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára Alkalmazása széleskörben elterjedt, a mindennapi orvosi diagnosztikától, az alapkutatás számos területén át, az ipari felhasználásig. Különböző igényeknek megfelelően számos műszer működik ezen az elven, ami a teljesen automatizált analízist is lehetővé teszi Ez egy érdekes és hasznos módszer, amivel érdemes foglalkozni!

44 Köszönöm a figyelmet!


Letölteni ppt "Áramlási citometria az orvosi diagnosztikában és gyógyszerkutatásban Dr. Milosevits Gergely."

Hasonló előadás


Google Hirdetések