Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei Nagy Gábor DEOEC III. Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium ODLA III.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei Nagy Gábor DEOEC III. Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium ODLA III."— Előadás másolata:

1 Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei Nagy Gábor DEOEC III. Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium ODLA III. évfolyam Immunológiai diagnosztikai módszerek március 16.

2 Diagnosztikai algoritmus Kezdeti vizsgálatok fizikális vizsgálat, anamnézis családi anamnézis vérkép, össz Ig osztályok mikrobiológia, mellkas röntgen szekunder immundef. kizárása Humorális immunr. szűrő jellegű vizsg. Speciális vizsgálatok Genetikai vizsgálatok Sejtes immunr. szűrő jellegű vizsg. Speciális vizsgálatok Genetikai vizsgálatok Fagocitasejt szűrő jellegű vizsg. Speciális vizsgálatok Genetikai vizsgálatok Komplement rendszer szűrő jellegű vizsg. Speciális vizsgálatok Genetikai vizsgálatok

3 Első vizsgálatok: vérkép metodika: metodika: –optikai elv –impedancia elv paraméterek: paraméterek: –össz fehérvérsejt szám –absz. limfocita szám –absz. granulocita szám –thrombocita szám és méret (MPV)

4 Első vizsgálatok: össz IgG, IgA, IgM Turbidimetria A fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri Nefelometria A szórt fény intenzitását méri

5 Immunglobulin szintek életkor függése Immunglobulinok mennyisége IgG Ig M IgA

6 Immunglobulin szintek: össz IgE Több nagyságrenddel alacsonyabb koncentráció Több nagyságrenddel alacsonyabb koncentráció ELISA (indirekt jelölésű) ELISA (indirekt jelölésű) kU/l kU/l hiper IgE-sy hiper IgE-sy

7 Össz Ig szintek változása immundeficienciákban hipogammaglobulinémia esetén ki kell zárni a veszést (pl. nephrosis sy) hipogammaglobulinémia esetén ki kell zárni a veszést (pl. nephrosis sy) Szelektív IgA hiány: Szelektív IgA hiány: –se és nyál IgA mérhetetlenül alacsony Hiper IgM: IgM , IgA , IgG  Hiper IgM: IgM , IgA , IgG  Hiper IgE: IgE  (>2000 kU/l) Hiper IgE: IgE  (>2000 kU/l) congenitális agammaglobulinémia: IgG, A, M   congenitális agammaglobulinémia: IgG, A, M   CVID: Ig  (>=két Ig osztályban) CVID: Ig  (>=két Ig osztályban) ALPS: Ig  ALPS: Ig 

8 Szűrő jellegű vizsgálatok Immunológiai szűrőtesztek immundefektus gyanúja esetén Feltételezett immundefektus Immunológiai teszt Humorális Szérum -IgM, -IgG, -IgA és alosztály vizsgálatok Izohemagglutinin-titer Fehérje antigénre adott immunválasz (Diphtheria toxin e.antitest, Tetanus toxin e.antitest) Poliszacharid antigénre adott immunválasz (H.influenzae e.antitest, Pneumococcus e.antitestek) Sejtes Abszolút limfocitaszám Tuberkulin-bőrtesztTetanus-bőrtesztDiphteria-bőrtesztCandida-bőrteszt Fagocitasejt-defektus Abszolút granulocitaszám NBT teszt Szérum IgE Komplementdefektus Összkomplement-aktivitás mérése hemolitikus módszerrel (klasszikus és alternatív út)

9 Humorális immunrendszer: IgG alosztályok G1, G2, G3, G4 alosztályok G1, G2, G3, G4 alosztályok metodika: nefelometria metodika: nefelometria az össz IgG ált normális tartományban van (kivéve, ha IgG1 hiányzik) az össz IgG ált normális tartományban van (kivéve, ha IgG1 hiányzik) izolált alosztály deficiencia izolált alosztály deficiencia szelektív IgA hiány mellett gyakran szelektív IgA hiány mellett gyakran

10 Izohemagglutinin az A és B vércsoport ellenes, alacsony affinitású IgM típusú At-ek, melyek a vércsoport-szabálynak megfelelően fiziológiásan megjelennek, valószínűleg bakteriális Ag-ek keresztrekaciója miatt az A és B vércsoport ellenes, alacsony affinitású IgM típusú At-ek, melyek a vércsoport-szabálynak megfelelően fiziológiásan megjelennek, valószínűleg bakteriális Ag-ek keresztrekaciója miatt hiányuk B-sejt defektusra utal hiányuk B-sejt defektusra utal módszer: hemagglutináció módszer: hemagglutináció hiányzik: pl. CVID hiányzik: pl. CVID

11 Fehérje és poliszacharid specifikus antitestek Fehérje antigénre adott immunválasz Fehérje antigénre adott immunválasz –Diphtheria toxin e. antitest –Tetanus toxin e. antitest Poliszacharid antigénre adott immunválasz Poliszacharid antigénre adott immunválasz –H. influenzae e. antitest –Pneumococcus e. antitestek –Meningococcus e. antitestek módszer: ELISA módszer: ELISA

12 Fehérje és PS specifikus antitestek csökkent válasz: CVID

13 Sejtes immunrendszer vizsgálatai: Absz. limfocita szám Absz. limfocita szám Absz. limfocita szám –életkorfüggő referencia tartomány –elsősorban a T-sejtszámot tükrözi –limfopénia: SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris dysgenesis) SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris dysgenesis) cong. agammaglobulinémia cong. agammaglobulinémia –csökken lehet: CVID

14 Bőrtesztek T-sejt funkció jó szűrőtesztje T-sejt funkció jó szűrőtesztje vírus és gomba fertőzések vírus és gomba fertőzések antigén: antigén: –Tuberkulin-bőrteszt –Tetanus-bőrteszt –Diphteria-bőrteszt –Candida-bőrteszt elve: késői típusú hiperszenz. elve: késői típusú hiperszenz. in vitro: limfocita proliferációs tesztek in vitro: limfocita proliferációs tesztek

15 Áramlási citometria

16 T limfocita markerek:CD3, CD2, CD7 T limfocita markerek:CD3, CD2, CD7 B limfocita markerek: CD19, CD20, CD21 B limfocita markerek: CD19, CD20, CD21 Helper T limfocita marker:CD4 Helper T limfocita marker:CD4 Citotoxikus T limfocita marker:CD8 Citotoxikus T limfocita marker:CD8 NK sejt markerek:CD56, CD16 NK sejt markerek:CD56, CD16 T sejt aktivációs markerek:CD69, CD25, HLA-DR T sejt aktivációs markerek:CD69, CD25, HLA-DR Neutrofil granulocita markerek:CD16, CD32 Neutrofil granulocita markerek:CD16, CD32 Monocita markerek:CD13, CD14 Monocita markerek:CD13, CD14 Makrofág markerek:CD36, CD68, CD71 Makrofág markerek:CD36, CD68, CD71

17 Áramlási citometria limfocita szubpopuláció: limfocita szubpopuláció: –T: CD3+ Th: CD4+ Th: CD4+ Tc: CD8+ Tc: CD8+ –B: CD19+ –NK: CD16+, CD56+

18 Áramlási citometria BetegségBTNK Bruton-kór-++ CVID+/-++ gamma-lánc def +-- ADA--- PNP+-- RAG1/2 def. --+ MHC-I def. + +(CD8  ) + MHC-II def. + +(CD4  ) + DiGeorge-sy++/-+

19 Áramlási citometria CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM) CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM) MHC I-II (MHC deficienciák) MHC I-II (MHC deficienciák) CD4-/CD8- T-sejt  : ALPS CD4-/CD8- T-sejt  : ALPS Treg  (CD4+,CD25bright,FOXP3+): Treg  (CD4+,CD25bright,FOXP3+): –Immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy X-linked (IPEX)

20 ADA, PNP enzimaktivitás purin anyagcsere enzimei purin anyagcsere enzimei –Adenozin dezamináz: adenozin-inozin átalakítás adenozin-inozin átalakítás –Purin nukleozid foszforiláz: guanozin-guanin guanozin-guanin inozin-hipoxantin átalakítás inozin-hipoxantin átalakítás Súlyos kombinált ID Súlyos kombinált ID –ADA: T és B –PNP: elsősorban T (valószínűleg a T sejtek magas dGTP tartalma miatt)

21 ADA, PNP enzimaktivitás eritrociták enzimaktivitását határozzuk meg eritrociták enzimaktivitását határozzuk meg vvt-ket 3x mossuk vvt-ket 3x mossuk beállítjuk a hgb-t beállítjuk a hgb-t lizáljuk a vvt-ket lizáljuk a vvt-ket megfelelő szubszrátot adunk a rendszerhez megfelelő szubszrátot adunk a rendszerhez –adenozin (ADA) –inozin (PNP) a keletkező végterméket UV spektrofotometriával mérjük a keletkező végterméket UV spektrofotometriával mérjük az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk meg az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk meg

22 ADA, PNP enzimaktivitás az enzimaktivitás: az enzimaktivitás: –homozigóta formában mérhetetlenül alacsony –heterozigóta formában kb. az kontrollok fele parciális ADA deficiencia: parciális ADA deficiencia: –vvt-ben nem mérhető aktivitás, de más szövetekben van (instabil enzim)

23 Fagocita rendszer vizsgálatai: abszolút neutrofil szám Kostmann sy Kostmann sy ciklikus neutropénia ciklikus neutropénia Chediak-Higashi sy Chediak-Higashi sy reticularis dysgenesis reticularis dysgenesis WHIM sy (Wart, Hypogammaglobulinem ia, Infection, and Myelokathexis syndrome) WHIM sy (Wart, Hypogammaglobulinem ia, Infection, and Myelokathexis syndrome) kemoth. kemoth. gyógyszerek gyógyszerek –immun –nonimmun autoimmun autoimmun alloimmun alloimmun hiányállapotok (B2, folsav, réz) hiányállapotok (B2, folsav, réz) AIDS AIDS

24 Fagocita sejtek vizsgálata: granulocita ellenes at. a mérés elve lehet: a mérés elve lehet: –áramlási citometria –sejtes ELISA

25 Fagocita sejtek vizsgálata: funkcionális vizsgálatok adherencia adherencia –granulocita szám mérés –üveggyönggyel inkubáció –granulocita szám mérés adhezív proteinek (áramlási citometria): adhezív proteinek (áramlási citometria): –LAD1: CD11a,b,c/CD18 –LAD2: CD15 kemotaxis kemotaxis –Boyden-kamra

26 Fagocita sejtek vizsgálata: funkcionális vizsgálatok fagocitózis fagocitózis –mikroszkóp: particulumok (élesztőgomba) –FC: FITC-cel jelölt immunglobulinnal preopszonizált E. coli –telepszámlálás: be nem kebelezett baktérium visszamérése intracelluláris killing intracelluláris killing –telepszámlálás: bekebelezés után életben maradt baktériumok visszamérése

27 Fagocita sejtek vizsgálata: funkcionális vizsgálatok oxidatív burst oxidatív burst –NBT (nitroblue-tetrasolium) redukció sárga NBT->kék/fekete formazán sárga NBT->kék/fekete formazán mikroszkópos kiértékelés mikroszkópos kiértékelés –DHR (dihidro-rodamin) oxidáció DHR->rodamin (fluoreszkál) DHR->rodamin (fluoreszkál) –teljes vér kemilumineszcencia H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát + foton H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát + foton –szuperoxid anion termelés ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal gátolható redukciója (fotometriás kiértékelés) ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal gátolható redukciója (fotometriás kiértékelés) csökkent: CGD csökkent: CGD

28 Fagocita sejtek vizsgálata: enzimdefektusok MPO MPO –primer, azurofil granulumban található enzim –H2O2->HOCl –deficienciája gyakori: 1:2000 –benzidin-hidrokloridot oxidálja->kék szín

29 Fagocita sejtek vizsgálata: mikroszkópos morfológia Chediak- Higashi sy Chediak- Higashi sy kóros a fagolizoszóma formálás kóros a fagolizoszóma formálás

30 Komplement rendszer: deficienciák

31 Komplement rendszer: össz komplement aktivitás klasszikus út: CH50 klasszikus út: CH50 –szenzitizált birka vvt. alternatív út: AH50 alternatív út: AH50 –nyúl vvt.

32 Komplement rendszer: CH50 meghatározás 50x 100x 200x 400x Vak Spontán lísis kontroll Teljes lízis kontroll Beteg1 Beteg2 Betegx hemolízis%= (ODminta-OD(SPLK))/OD(TLK)

33 Komplement rendszer: CH50 meghatározás logx=logK+1/n*log(y/(1-y)) x=szérum térfogat y=hemolízis% CH50=annak a szérumtérfogatnak a reciproka, ami 50%-os lízist okoz

34 Komplement rendszer: értékelés CPAPC3C4Magyarázat 0NNN C1q, C1r, C1s, C2 deficiencia 00N C3 def. 0NN C4 def. 00NN C5-C9 def NNHANO N CP comsumptio

35 Komplement rendszer: egyes faktorok antigén meghatározás: antigén meghatározás: –radiális immundiffúzió –rakétaelektroforézis –nefelometria –ELISA funkciónális meghatározás: funkciónális meghatározás: –hemolitikus assay (a mérendő faktor kivételével a faktorok feleslegben) –klasszikus út komponensei: szenzitizált birka vvt. –alternatív út komponensei: nyúl v. tengerimalac vvt.


Letölteni ppt "Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei Nagy Gábor DEOEC III. Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium ODLA III."

Hasonló előadás


Google Hirdetések