Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

10. SZEMINÁRIUM AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK ELVÁLASZTÁSA ÉS AKTIVITÁSUK MÉRÉSE.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "10. SZEMINÁRIUM AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK ELVÁLASZTÁSA ÉS AKTIVITÁSUK MÉRÉSE."— Előadás másolata:

1 10. SZEMINÁRIUM AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK ELVÁLASZTÁSA ÉS AKTIVITÁSUK MÉRÉSE

2 SEJTSZEPARÁLÁS Számunkra érdekes sejteket fizikailag elkülönítjük egy heterogén populáció többi tagjától A sejtek fizikai, biológiai vagy immunológiai különbözőségeit használjuk ki. (A sejtfelszíni markerek kifejeződésének mértékében is gyakori a különbség – lehetőség van a szeparált élő sejtek további vizsgálatára).  fizikai – sűrűség, méret  sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre  immunológiai – eltérő sejtfelszíni antigének A szeparálás eredményességét jelzi: tisztaság, visszanyerés hatékonysága, sejtek életképessége

3 KÉTFÉLE SZEPARÁLÁSI STRATÉGIA Pozitív szeparálás elkülöníteni kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől pl. a sejtek valamelyik sejtfelszíni molekuláját (CD markerét) fluoreszcens ellenanyaggal jelöljük A sejteket a szeparálási folyamat körülményei mellett a receptorához kötött ellenanyag direkt módon befolyásolhatja. A pozitív szeparáció viszont gyakran nagyobb tisztaságot eredményez. Negatív szeparálás a nem kívánatos sejtek megjelölése és megszabadulás tőlük A szeparálandó sejtet csak a procedúra egyéb körülményei befolyásolj ák. Funkcionális vizsgálatok esetén inkább ezt használják.

4 Perifériás vér (vagy buffy coat) Sejtek pipettázása a Ficollra centrifugálás Szeparált sejtek plazma ficoll Vörösvértestek Mononukleáris sejtek (PBMC) Neutrofil granulociták Mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása egy másik csőbe, hogy megszabaduljunk a Ficoll-tól FICOLL-PAQUE SŰRŰSÉG ALAPÚ SEJTSZEPARÁCIÓ

5 (Nature Protocols (from Google pictures)

6 Mágneses sejtszeparálás (MACS) Paramágneses szemcse Antigén specifikus ellenanyag A SEJTEK IMMUNOLÓGIAI TULAJDONSÁGAIN ALAPULÓ SZEPARÁLÁSI ELJÁRÁSOK

7 MÁGNES oszlop Nem jelölt sejtek eltávolítása (negatív szelekció)

8 Fluoreszcens sejtszeparálás (FACS) Például: NKT sejt szeparálás (CD3/CD56) NK sejtek NKT sejtek limfociták Vér minta T sejtek A SEJTEK IMMUNOLÓGIAI TULAJDONSÁGAIN ALAPULÓ SZEPARÁLÁSI ELJÁRÁSOK

9 Az áramlási cella vibrációjának hatására a folyadéksugár a frekvenciától függően, adott stabil helyen cseppekre bomlik cseppleszakadási pont

10 Lézer vibráció Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra elektromos töltés kapcsolódik (arra a rövid időre), így a leváló csepp töltötté válik. Elektromosan töltött eltérítő lemezek gyűjtőcső szemét Elektromosan töltött eltérítő lemezek gyűjtőcső

11 AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA FAGOCITÁLÓ SEJTEK – FAGOCITÓZIS VIZSGÁLAT •Különböző fluorofórokkal jelöltek elölt patogének alkalmazása (baktériumok: E. coli, S. aureus; élesztő: S. cerevisiae) •A fagocitózis detektálható fluoreszcens mikroszkóppal vagy áramlási citometriával

12 A limfociták specifikus antigénnel történő aktivációja alig detektálható (az antigénspecifikus sejtek száma alacsony) Poliklonális limfocitaaktivációt kiváltó anyagok segítenek az abnormális limfocita funkciók vizsgálatában LIMFOCITA AKTIVITÁS MÉRÉSE T- és/vagy B-sejtek funkcióját érintő immundeficienciák kimutatására

13 HUMÁN T ÉS B SEJTEK POLIKLONÁLIS AKTIVÁCIÓJA  Lektinek (pl. Concanavalin A és PHA) receptorok keresztkötésén keresztül hatnak  Intracelluláris jelátviteli kaszkád aktivátorok (PMA – PKC aktivátor, Ionomycin – emelkedett intracelluláris Ca 2+ szint)  Specifikus antitestek (anti-IgM, anti-CD3, anti-TCR)

14 POLIKLONÁLIS B SEJT AKTIVÁTOROK POLIKLONÁLIS T SEJT AKTIVÁTOROK Pokeweed (álkörmös) mitogen (PWM) Staphylococcus protein A szuperantigén (SpA) Epstein Barr Vírus (EBV) (transzformáló hatás) Anti-IgM antitest Phytohaemagglutinin (PHA) Concanavalin A (ConA) Anti-CD3, Anti-TCR antitestek Canavalia ensiformis Phytolacca americana Phaseolus vulgaris

15 Receptorok ligand általi keresztkötése (pillanatszerű) Foszforilációs lépések (másodpercek-percek) -Western blot i.c. Ca 2+ emelkedés -Áramlási citometria -Fluoreszcens mikroszkópia Génaktiváció -qRT-PCR  mRNS -Western blot  fehérje Citokin szintézis Citokin szekréció -i.c. citometria - ELISA - ELISPOT Antigén receptorok (TCR, BCR), citokin receptorok, stb. Életképesség/apoptózis-halott sejtekre specifikus festékek Sejtosztódás - 3 H-thymidine -CFSE -MTT Limfocita aktiváció A vizsgálat gyakran specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

16 Fluoreszcencia arányos az intracelluláris Ca 2+ koncentrációval idő alapjel sejtaktiváció Fluo-3 vagy Indo-1 A CA 2+ SZIGNÁL MÉRÉSE ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁVAL A citoplazmatikus Ca 2+ koncentráció mérése fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható /Fluo-3 vagy Indo-1/

17 INTRACELLULÁRIS CITOKINTERMELÉS KIMUTATÁSA IMMUNFLUORIMETRIÁVAL jelölt citokin- specifikus ellenanyagok cytokines  a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá lehet tenni  de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció)  előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker”, pl. CD4)

18 A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható Pl. citokin gének aktivációja KVANTITATÍV (REAL-TIME) PCR (qPCR/qRT-PCR)  sejtek  RNS izolálás  RNS  reverz transzkripció (RT-PCR)  cDNS  cDNS  polimeráz láncreakció (PCR)  mennyiségi meghatározás (a génaktiváció fehérje szinten történő vizsgálata  WB) GÉNAKTIVÁCIÓ VIZSGÁLATA minél több mRNS-t tartalmazott a minta, annál hamarabb (kevesebb ciklus alatt) éri el az amplifikáció a küszöböt

19 ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot  elve hasonló az ELISA-hoz  Ig-okat, citokineket, kemokineket, granzimet és más oldott effektor molekulákat termelő sejtek számának meghatározása  érzékeny módszer: 1 aktivált sejt kimutatása közül. (Nemcsak poliklonális, de antigén specifikus aktivációt követően is kimutatja az aktivált sejteket.)

20 - Antigén specifikus „capture” ellenanyagok kitapasztása - Blokkolás - Sejtek hozzáadása - Biotinnal konjugált antigén specifikus másodlagos ellenanyag hozzáadása - Avidin-enzim konjugátum - Oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-ethylcarbazol ) (aktiváció, inkubáció) - Mosás Citokintermelő sejt helyét jelölő folt Az ELISPOT lemez egy lyukának felülnézete a képződött foltokkal ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot

21 Leolvasás mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy „ELISPOT plate reader” segítségével (gyors, standardizálható - spotok számának és méretének meghatározása)

22 ÉLETKÉPESSÉG VIZSGÁLAT MTT (Dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium só) Életképesség kolorimetriás mérése (apoptótikus sejtek). NADPH-függő celluláris oxireduktáz enzimek az MTT festéket oldhatatlan lila színű formazánná redukálják. PI (propidium-jodid) Egy fluoreszcens molekula, amely képes a nukleinsavba beépülni. Áramlási citometriával vizsgálható az életképesség. Élő sejtekbe nem képes behatolni. 7-AAD (7-aminoactinomycin D) Egy fluoreszcens molekula, amely duplaszálú DNS-be interkalálódik. Élő sejtek membránján nem képes átjutni, vagyis használható életképesség mérésre áramlási citometriával.

23 SEJTOSZTÓDÁS VIZSGÁLATOK 3 H-jelölt timidin beépülés- a növekvő DNS tartalmat méri (β-bomlás mérése). Nem detektálja, hogy hány sejt hányszor osztódott. Bromodeoxyuridin (BrdU) - timidin-analóg, adható kísérleti állatokba vagy sejtkultúrákhoz. Az osztódó sejtek BrdU specifikus ellenanyagok felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS). CFSE (Karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter) Fluoreszcens festék, amely könnyen bejut a sejtekbe és intracelluláris amin struktúrákhoz kötődik. Tanulmányozható a sejtosztódás, migráció, elhelyezkedés.

24 CFSE SEJTOSZTÓDÁS NYOMON KÖVETÉSE  „Cell tracer” festékek bekerülnek a sejtekbe és csapdába esnek  Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez  In vitro és in vivo nyomon követhető a limfociták osztódása Fokozatosan a felére csökken a fluoreszcencia intenzitás az utódsejtekben CFSE-vel jelölt nem osztódó, nem aktivált sejtek fluoreszcens intenzitása


Letölteni ppt "10. SZEMINÁRIUM AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK ELVÁLASZTÁSA ÉS AKTIVITÁSUK MÉRÉSE."

Hasonló előadás


Google Hirdetések