TRANSZPLANTÁCIÓSIMMUNOLÓGIA LÁNYI ÁRPÁD PhD. AUTOLÓG SZERV, SZÖVET VAGY SEJT TRANSZPLANTÁCIÓ Bőr, izom, dendritikus sejt, porc Hematopoetikus sejtek (HSC)

Az előadások a következő témára: "TRANSZPLANTÁCIÓSIMMUNOLÓGIA LÁNYI ÁRPÁD PhD. AUTOLÓG SZERV, SZÖVET VAGY SEJT TRANSZPLANTÁCIÓ Bőr, izom, dendritikus sejt, porc Hematopoetikus sejtek (HSC)"— Előadás másolata:

1 TRANSZPLANTÁCIÓSIMMUNOLÓGIA LÁNYI ÁRPÁD PhD

2 AUTOLÓG SZERV, SZÖVET VAGY SEJT TRANSZPLANTÁCIÓ Bőr, izom, dendritikus sejt, porc Hematopoetikus sejtek (HSC) autograft szingraft SZINGÉNALLOGÉN Vese, szaruhártya, máj, szív, tüdő Hematopoetikus sejtek (HSC) allograft

3 Az első humán vérátömlesztés 1818 NÉHÁNY MÉRFÖLDKŐ A TRANSZPLANTÁCIÓBAN James Blundell brit szülész a szülés során bekövetkező vérveszteség pótlására végzett vérátömlesztést (négy uncia) férj és feleség között. Ez volt az első jól dokumentált vérátömlesztés. Tíz másik nő kapott hasonló okból vérátömlesztést, a módszer sikere 50%-os volt. Photo: Blundell's Gravitator Source: NIH/ Pennsylvania State University Libraries

4 Az első kísérletek csontvelő átültetésére 1896 Az étkezés után orálisan adott csontvelőt leukémia kezelésére próbálták használni, eredménytelenül. A következő néhány évben, az aplasztikus anémia kezelésére intravénásan adott csontvelővel elértek némi eredményt. Már a 18. században végeztek sikereses (főként) bőrátültetéseket állatokon. Az első sikeres bőr allograft 1869 Jacques Louis Reverdin Pajzsmirigy transzplantáció 1883 Theodor Kocher A pajzsmirigy transzplantáció elindította az új terápiás módszer, a szervátültetés elterjedését. A századforduló körüli évtizedekben számos szerv átültetését kísérelték meg, több-kevesebb sikerrel. Az ABO vércsoportrendszer felfedezése 1902 Karl Landsteiner Az első xenotranszplantáció 1906 Egy francia sebész próbált nyúlvesével segíteni egy veseelégtelenségben szenvedő gyermeken. A gyerek két hétig élt. Négy évvel később egy higany- mérgezésben szenvedő fiatal lány kapott majomvesét. Némi vizelet képződött, de a lány csak öt napig élt. Az első sikeres csontátültetés 1878 Mivel nem volt mód a humán szövetek konzerválására, a módszer nem terjedt el. NÉHÁNY MÉRFÖLDKŐ A TRANSZPLANTÁCIÓBAN

5 Az MHC felfedezése 1940-es évek George Snell Humán HLA: 1958 Jean Dausset Az első sikeres humán vese szingraft 1954 Joseph E. Murray Az első sikeres humán szívátültetés 1967 „Működik!„ – kiáltotta Dr. Christiaan Barnard, amint a 23 éves, autóbalesetben elhunyt Denise Darvall szíve dobogni kezdett az 54 éves Louis Washkansky mellkasában. A transzplantációt a fokvárosi Groote Schuur kórházban végezték. Washkansky 18 nappal később hunyt el, az immunszupresszió miatt fellépő pneumonia következtében. Az első sikeres csontvelő allograft 1973 Az átültetést New York-ban, a Sloan-Kettering Center-ben végezték. Egy dán férfiből származó csontvelőt ültettek be egy öt éves SCID betegbe. Az ezt megelőző sikeres csontvelő transzplantációkat rokonok között végezték. NÉHÁNY MÉRFÖLDKŐ A TRANSZPLANTÁCIÓBAN

6 ÁTÜLTETETT SZERVVEL ÉLŐK AZ EGYESÜLT ÁLLAMOKBAN

7 SZÖVET/SZERV TRANSZPLANTÁCIÓ A transzplantáció sikere főként a hisztokompatibilitástól függ

8 A SZINGÉN GRAFTOK FENNMARADNAK, MÍG AZ ALLOGRAFTOK KILÖKŐDNEK EGEREKBEN ÉS EMBEREKBEN IS

9 ALLOGÉN FELISMERÉS

10 AZ ALLOANTIGÉNEK DIREKT ÉS INDIREKT FELISMERÉSE

11 AZ ALLOGÉN MHC MOLEKULÁK DIREKT FELISMERÉSÉNEK MOLEKULÁRIS ALAPJA Az allogén MHC molekulák direkt felismerése nagyon erős T-sejt választ indukál. A T-sejt populáció 1-2%-a képes az allogén MHC molekulák direkt felismerésére. Ez a szám 100-1000X nagyobb, mint infekció esetén. Az MHC molekulák számos különböző, a donor celluláris proteinjeiből származó peptiddel alkothatnak komplexet, ami különböző T-sejt klónok aktivációjához vezet. Minden APC MHC molekulák ezreit expresszálja: ha ezek idegen MHC molekulák, közülük sokat, vagy akár mindet felismerhetik alloreaktív T- sejtek (infekció: 0.1-0.9%). Számos memória T-sejt keresztreagálhat az allogén MHC molekulákkal.

12 Alapjaiban a fertőzés során történő antigén felismeréshez hasonlítható. AZ ALLOANTIGÉNEK DIREKT ÉS INDIREKT FELISMERÉSE

13 AZ ALLOREAKTÍV T-SEJTEK AKTIVÁCIÓJA Graft antigénekre (főként HLA) specifikus ellenanyagok is hozzájárulnak a kilökődéshez. A T-sejt dependens ellenanyag termelés a fertőzések során bekövetkező antitest termeléshez hasonló módon zajlik (az indirekt felismerés egy példája).

14 GRAFT KILÖKŐDÉS

15 A LEGGYAKORIBB SZÖVET-TRANSZPLANTÁCIÓ A VÉRÁTÖMLESZTÉS Az inkompatibilitás crossmatch teszttel ellenőrizhető. Recipiens szérum/donor eritrocita A szervátültetéshez elengedhetetlen a vércsoport antigének kompatibilitása A vércsoport antigének inkompatibilitása II-es típusú hiperszenzitivitási reakcióhoz vezet

16 HIPERAKUT GRAFT KILÖKŐDÉS ANTITEST-MEDIÁLT II-ES TÍPUSÚ HIPERSZENZITIVITÁSI REAKCIÓ Az inkompatibilitás legdramatikusabb formája, percekkel vagy órákkal az átültetést követően Az endoteliális sejtek expresszálják a VÉRCSOPORT ANTIGÉNEKET ANTITESTEK (IgM) – KOMPLEMENT FIXÁCIÓ – NEUTROFIL, TROMBOCITA AKTIVÁCIÓ – INTRAVASCULARIS KOAGULÁCIÓ – IRREVERZIBILIS ISCHAEMIÁS NEKRÓZIS Csak elkerülni lehet, visszafordítani nem!! Manapság az ABO inkompatibilitás következtében fellépő hiperakut kilökődés nem nagyon fordul elő, DE Az endoteliális sejtek HLA I molekuláját felismerő, főként IgG antitestek szintén hiperakut kilökődést okoznak!! Honnan származnak a HLA-specifikus antitestek?

17 Terhesség (szülés) Egymást követő terhességek során az anti-HLA antitestek szintje nő Vérátömlesztés (trombocita, leukocita) HLA tipizálást nem végeznek, csak az ABO és Rh kompatibilitást ellenőrzik Korábbi szervátültetés Cross-match!!! ANTI-HLA ANTITESTEK KELETKEZÉSE

18 CROSSMATCH TESZTEK Komplement-dependens citotoxicitás A donor limfocitákat izolálják A recipiens szérumát a donor limfocitáihoz adják A hozzáadott komplement általában nyúlszérumból származik A donor-specifikus antitestek jelenléte a limfociták líziséhez vezet DOI: 10.1111/j.1440-1797.2010.01414.x

19 Áramlási citometria Érzékenyebb A T- és B- sejtek szeparációja lehetővé teszi az MHCI- és MHCII-specifikus antitestek detektálását Az MHCI-specifikus antitestek a T- és B- sejtekhez is kötődnek Az MHCII-specifikus antitestek csak a B- sejtekhez kötődnek DOI: 10.1111/j.1440-1797.2010.01414.x CROSSMATCH TESZTEK

20 Panel reaktív antitest (PRA) A páciens szérumának tesztelése a populációt reprezentáló leukocita antigénekkel szemben A pozitív reakciók számát százalékban adják meg DOI: 10.1111/j.1440-1797.2010.01414.x Bb Beads: CROSSMATCH TESZTEK

21 AKUT GRAFT KILÖKŐDÉS T-SEJT-MEDIÁLT IV-ES TÍPUSÚ HIPERSZENZITIVITÁSI REAKCIÓ Napok vagy hetek alatt alakul ki Th1, Th17, CD8+ T-sejtek, makrofágok Antitestek, komplement, neutrofilek, trombociták A kilökődött graft duzzadt, mélyvörös haemorrhagiás és szürke nekrotikus foltokkal tarkított.

22 VESE GRAFTSZÍV GRAFT Plazmasejtek T-SEJTEK Limfociták a vesetubulusok körül T limfociták a myocardiumban (CD3+) Limfociták egy arteriola körül (A) A vesetubulusokat körülvevő limfociták (T) CD3 festés ugyanabban a szekcióban (barna) AKUT GRAFT KILÖKŐDÉS T-SEJT-MEDIÁLT IV-ES TÍPUSÚ HIPERSZENZITIVITÁSI REAKCIÓ

23 KRÓNIKUS GRAFT KILÖKŐDÉS III-AS TÍPUSÚ HIPERSZENZITIVITÁSI REAKCIÓ E: endotélM: makrofág G: granulocitaEL: elasztikus réteg T: alloreaktív TSMC: simaizomsejt Az érfalak megvastagodása, az érlumen beszűkülése Megvastagodott falú artéria egy kilökődött vese graftban

24 A GRAFT-TÚLÉLÉS ÖSSZEHASONLÍTÁSA ÉLŐ ÉS NEM- ÉLŐ DONOROS VESEÁTÜLTETÉST KÖVETŐEN 10.5812/numonthly.12182

25 A HLA AZONOSSÁG JAVÍTJA AZ ÁTÜLTETETT SZERVEK (ITT:VESE) TÚLÉLÉSI ESÉLYEIT Kék Narancs Piros Sötétkék Zöld Fekete Barna A HLA-DR, B és A egyezés a legfontosabb

26 HLA TIPIZÁLÁS

27 KEVERT LIMFOCITA REAKCIÓ Az alloreaktív T-sejtek idegen MHC-ra adott válasza in vitro analizálható

28 HLA TIPIZÁLÁS DNS-ALAPÚ TIPIZÁLÓ MÓDSZEREK PCR-SSOPH: Szekvencia-specifikus oligonukleotid próba hibridizáció TAGCGAT ATCGCTA TAGAGAT ATCTCTA Minta 1 (A*0203) Minta 2 (A*0501) Minta 1 (A*0203) Minta 2 (A*0501) Amplifikáció, denaturáció, felvitel a memránra Minta 1 Minta 2 Hibridizáció allél-specifikus próbával...TAGCGAT..(A*02)...TAGAGAT…(A*05) Specimen 1 Specimen 2 Specimen 1 Specimen 2 Közepes feloldású Potenciális donorok azonosítása, páciensek „előtesztelése” Nagy áteresztőképesség, viszonylag olcsó

29 SSP-PCR: Szekvencia-specifikus PCR (allél-specifikus primerek) Kontroll Allél-specifikus termék SSP: Szekvencia-specifikus primer Nincs amplifikáció SSP Amplifikáció SSP kötődés Nincs SSP kötődés Kontroll Allél-specifikus termék Agaróz gél Reagens kontroll Nagyon gyors teszt, 3-4 órát vesz igénybe Általában halott donorok tipizálására használják A különböző allélokra specifikus primerek elérhetők 96 lyukú lemezre vitt formátumban HLA TIPIZÁLÁS DNS-ALAPÚ TIPIZÁLÓ MÓDSZEREK

30 SBT: Szekvencia-alapú tipizálás A polimorf régiók amplifikációját szekvenálás követi A legnagyobb feloldású HLA tipizáló módszer Forward PCR primer Szekvenáló primerek Reverz PCR primer A kapott szekvenciák összehasonlítása a referencia szekvenciákkal HLA TIPIZÁLÁS DNS-ALAPÚ TIPIZÁLÓ MÓDSZEREK

31 MÉG A TELJES HLA AZONOSSÁG SEM BIZTOSÍTJA A GRAFT TÚLÉLÉSÉT MINOR HISZTOKOMPATIBILÁSI ANTIGÉNEK A polimorf celluláris proteinekből származó peptidek az MHCI molekulákhoz kötődnek A minor H antigének által indukált reakció a vírusellenes immunválaszhoz hasonló

32 MINOR HISZTOKOMPATIBILITÁSI ANTIGÉNEK

33 IMMUNSZUPRESSZÍV TERÁPIA

34 DEPLETÁLÓ ANTITESTEK A depletáló antitesteket általános immunszupresszánsként a transzplantációt megelőzően és azt követően is használják. Nyúl antitimocita globulin (rATG) Nagy affinitású poliklonális antitestek keveréke T-, B-, NK, dendritikus és endoteliális sejtekhez kötődik Komplement fixáció, fagocitózis Szérumbetegség Alemtuzumab: anti-CD52 CD52-specifikus humanizált patkány monoklonális IgG A CD52-t majdnem minden limfocita, a makrofágok és a dendritikus sejtek is expresszálják Az Alemtuzumab hosszútávú limfopeniát indukál

35 KORTIKOSZTEROIDOK Hatékony immunszupresszánsok A transzplantációt megelőzően és a kilökődési epizódok során használják Az IKB-n keresztül gátolja az NFkB aktivitást (a gyulladásos válasz központi transzkripciós faktora) Gátolják a limfociták másodlagos nyirokszervekbe való belépését Számos káros mellékhatása van: folyadékvisszatartás, súlynövekedés, diabetes, a csont ásványi anyag tartalmának csökkenése, a bőr elvékonyodása Hosszútávú használata kerülendő

36 Kalcineurin inhibitorok: cyclosporin, tacrolimus Mellékhatások: Neurotoxicitás, Nefrotoxicitás, Diabetes T-SEJT AKTIVÁCIÓT GÁTLÓ IMMUNSZUPRESSZÁNSOK

37 A CYCLOSPORIN GRAFT TÚLÉLÉSRE GYAKOROLT HATÁSA

38 A KO-STIMULÁCIÓ GÁTLÁSA: BELATACEPT A belatacept a már bevált szerekhez hasonlóan hatékonyan gátolja a T-sejt választ, emellett nem okoz vesekárosodást. Ugyanakkor használata során gyakoribbak a kilökődési epizódok.

39 AZ IL-2 JELÁTVITEL GÁTLÁSA Kiméra basiliximab, humanizált daclizumab: CD25-specifikus monoklonális IgG1 antitestek A transzplantáció előtt és az azt követő első két hónapban alkalmazzák, amikor az akut kilökődés esélye a legnagyobb. 24 órán belül telíti az összes CD25-öt, félélet- ideje 2 hét, hatása több, mint egy hónapig tarthat. Az aktivált T-sejtekre specifikus, nem okoz széles körű immunszupressziót.

40 AZ IL-2 JELÁTVITEL GÁTLÁSA Rapamycin (sirolimus) Immunszupresszív makrolid (Streptomyces hygroscopicus) Az FKBP12-höz kötődik, de nem kalcineurin inhibitor mTOR inhibitor, gátolja az IL-2 receptor jelátvitelt Toxikusabb, mint a cyclosporin vagy a tacrolimus, kombinált terápiában használják Nem gátolja jelentősen a Treg funkciókat Dendritikus sejtek, B-sejtek doi:10.1016/S0167-7799(98)01239-6

41 REPLIKÁCIÓT ÉS PROLIFERÁCIÓT GÁTLÓ CITOSZTATIKUMOK Citotoxikus szereket csak a transzplantációt követően alkalmaznak Azathioprin: veseátültetés Inaktív „prodrug”, 6-merkaptopurin-ná majd 6-tioinozinsav-vá konvertálódik Az utóbbi gátolja az adenin és guanin bioszintéziséhez szükséges inozinsav képződését Nem szelektív, károsítja az aktívan osztódó szöveteket: csontvelő, intestinalis epitelium, hajtüsző: anémia, leukopénia, trombocitopénia, bélkárosodás, hajvesztés Mycophenolat-mofetil: Penicillium stoloniferum Az azathioprin-hez hasonló hatás A májban mikofenolsavvá metabolizálódik A guanin szintézishez szükséges inozin-monofoszfát- dehidrogenázt gátolja

42 Citotoxikus szereket csak a transzplantációt követően alkalmaznak Cyclophosphamid: Vegyi fegyvernek alkották (1. vh) Foszforamid mustár-rá metabolizálódik ami erős alkiláló szer, keresztköti a DNS-t Károsítja a húgyhólyagot, rákot vagy hólyaggyulladást (haemorrhagias cystitist) okozhat Az azathioprin-től eltérően, a ciklofoszfamid nem különösebben káros a májra, alternatíva lehet a májkárosodott páciensek számára Rövid idejű, repetitív alkalmazás a leghatékonyabb Methotrexate: A timidin szintézishez szükséges dihidrofolát-reduktáz-t gátolja REPLIKÁCIÓT ÉS PROLIFERÁCIÓT GÁTLÓ CITOSZTATIKUMOK

43 ÖSSZEFOGLALÁS: AZ EGYES IMMUNSZUPRESSZÁNSOK A T- SEJT AKTIVÁCIÓ KÜLÖNBÖZŐ FÁZISAIBAN FEJTIK KI HATÁSUKAT

44 A CÉL: DONOR-SPECIFIKUS TOLERANCIA Hematopoetikus kimérák létrehozása A méhen belüli fejlődés során közös vérkeringéssel rendelkező kétpetéjű ikrek toleránsak egymás szöveteivel szemben. A szervátültetés HSCT-vel való kombinációja elősegíthetné egy stabil tolerancia kialakulását,hosszútávú immunszupresszió nélkül Bíztató eredmények: vese/csontvelő allograftok Haploidentikus családtagok Nem-mieloablatív kondicionálás: cyclophosphamid, cyclosporin, anti- CD2 antitest, tímusz besugárzás Az immunszupresszív terápia 9–14 hónap után elhagyható volt Túlélés: 10 év Treg transzfer Donor-specifikus T-regek előállítására és transzplantációs terápiában való felhasználására vonatkozó klinikai kísérletek folyamatban vannak.

45 A HLA AZONOSSÁG ÉS AZ IMMUNSZUPRESSZIÓ IGÉNYE NEM MINDEN SZÖVET/SZERV ESETÉBEN EGYFORMA Anterior kamra-asszociált immundeviáció (ACAID) Anti-inflammatorikus, de a patogénnekkel szembeni védelmet fenntartó környezet A szaruhártya nem vaszkularizált Az anterior kamra immunmodulátor faktorokat tartalmaz (TGF-β) Tolerogén DC-k, Tregek, IL-4, TGF-β. Szaruhártya átültetés: 90%-os siker HLA azonosság hiányában, immunszupresszív terápia nélkül Máj Speciális szerkezet és érhálózat A HLA I nagyon alacsonyan expresszálódik, HLA II nincs Az emésztőrendszerrel való szoros kapcsolata miatt rengeteg nem saját antigén jut be a májba (tolerogénebb mikrokörnyezet) A kilökődés ritkább, mint más szervek esetében HLA tipizálás, cross-match nem előzi meg az átültetést, vércsoport ellenőrzés van Cyclosporin, tacrolimus kezelés javítja a sikeres transzplantáció esélyét A spektrum másik oldalán helyezkedik el a csontvelő

46 HEMATOPOETIKUS ŐSSEJT TRANSZPLANTÁCIÓ

47 HEMATOPOETIKUS ŐSSEJT TRANSZPLANTÁCIÓ (HSCT) Mieloablatív terápia: citotoxikus szerek és besugárzás kombinációja Engraftment: a pluripotens őssejtek kolonizálják a csontokat Az immunrendszer rekonstitúcióját követően (egy év vagy több) a páciens kiméra lesz (genetikailag eltérő immunrendszer) Hematopoetikus őssejtek már a vérből is kinyerhetők G-CSF, GM-CSF: az őssejtek kiűzése a csontvelőből Leukaferezis Izoláció: CD34 0.25-0.5x10 9 CD34+ sejt szükséges a gyors engraftmenthez

48 MINÉL NAGYOBB HLA AZONOSSÁG, ANNÁL ERŐTELJESEBB T-SEJT VÁLASZ

49 A HSCT SIKERE KORRELÁL AZ MHC AZONOSSÁGGAL

50 GRAFT-VERSUS-HOST BETEGSÉG: ALLOREAKTÍV DONOR T- SEJTEK MEGTÁMADJÁK A RECIPIENS SZÖVETEIT A HLA azonosság esetén kialakuló GVHD-t a minor hisztocompatibilitási antigének indukálják A mieloablatív terápia során egyéb szövetek is sérülnek: bőr, intestinalis epitelium, hepatociták Citokin vihar, dendritikus sejt aktiváció A recipiens dendritikus sejtjei aktiválják a donor alloreaktív T-sejtjeit Methotrexate cyclosporin-nal kombinálva A GVHD növeli a sikeres engraftment esélyét

51 A köldökzsinórvér hematopoetikus őssejtekben gazdag, alloreaktív T-sejtekből pedig keveset tartalmaz Kevésbé súlyos GVHD, nagyobb HLA eltérés tolerálható Az engraftment lassúbb Mennyisége limitált: két nem rokon donorból származó minta kombinációja használatos A páciens hematopoetikus rendszere kiméra lesz, de idővel az egyik donorból származó sejtek lesznek a dominánsak Először 1988-ban alkalmazták a módszert egy Fanconi anémiában szenvedő gyerek kezelésére Azóta több, mint 25,000 ilyen jellegű transzplantációt végeztek KÖLDÖKZSINÓRVÉR, MINT A HEMATOPOETIKUS ŐSSEJTEK FORRÁSA

52 NÉHÁNY HSCT-VEL KEZELHETŐ ÖRÖKLŐDŐ BETEGSÉG HSCT-vel számos örökletes immundeficiencia is kezelhető, például SCID.

53 HSCT A TUMOR TERÁPIÁBAN Autolog HSCT Az ablatív kezelés előtt mintát vesznek a csontvelőből. A tumorsejteket eltávolítják a mintából és az ablatív terápiát követően a hematopoetikus őssejteket visszajuttatják a páciensbe. Perfekt hisztokompatibilitás: nincs GVHD, nincs szükség immunszupresszióra Autolog graft esetén a betegség kiújulásának esélye nagyobb, mint allogén graftoknál

54 GRAFT-VERSUS-LEUKÉMIA (GVL) EFFEKT A donor alloreaktív T-sejtjei megtámadják a recipiens tumorsejtjeit Kisebb hangsúlyt fektetnek a tumorsejtek eliminációjára, GVL reakciót elősegítő terápia Nem-mieloablatív kondicionáló terápia Donor T-sejtek transzfúziója a transzplantációt követő olyan időpontban, amikor a kondicionáló terápia egyéb szövetekre gyakorolt hatása már elmúlt, így a GVHD valószínűsége kisebb.

55 Haploidentikus graft NK SEJT-MEDIÁLT GVL EFFEKT GVHD megelőzés: T-sejt depléció, anti-T-sejt antitest infúzió A transzplatációt követően nincs immunszupresszív terápia Az NK sejtek hamarabb megjelennek, mint a T- sejtek, ezek között alloreaktív NK sejtek is lehetnek Az inhibitor KIR receptorok és a HLA-B/C közötti interakciók által meghatározott NK sejt-mediált alloreakciók előfordulása és specificitása a donor és a recipiens HLA típusa alapján prediktálható NK sejtes alloreakciók akkor történnek, amikor a recipiens sejtjei kevésbé gátolják az NK sejteket, mint a donor sejtjei. AML+, ALL- Az alloreaktiv NK válasz idővel gyengül, az immunrendszer rekonstitúcióját követően pedig az NK-sejtek toleránsak lesznek mind a recipiens, mind a donor sejtekkel szemben.

56 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET