Kromatográfia Ajánlott irodalom Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., Budapest, 1997. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, BME jegyzet, Budapest, 2003. Gáspár Attila: Kapilláris zónaelektroforézis, DTE, Debrecen, 2000.

ilusztráció ilusztráció

Tswett első kromatogramja

104 illékony szerves anyag (VOC) gázkromatogramja Minőségi mutató: retenciós idő (tR), Mennyiségi mutató: csúcsterület (A)

Kromatográfia előnyei Pontos mennyiségi meghatározás , akár nyomnyi komponensekre is. A mátrix komponensek hatása kiküszöbölhető. Kicsi mintaszükséglet. Mennyiségi meghatározások több nagyságrendben. Számos vegyület meghatározható egy analízis alatt. Gyors módszer. On-line csatolás szerkezeti meghatározó (MS, NMR, IR) módszerekhez, Fejlett műszerezettség, automatizáltság.

Nyomnyi szennyezések pontos megállapítása

Nyomnyi mennyiségek meghatározása összetett mátrixból

Gyors analízisek

On-line GC/MS kapcsolás kiválasztott ion (SIM) módban

GC automata injektor Az automata injektor nem csak az emberi felügyelet nélküli munkát teszi lehetővé, de a pontosságot is nagy mértékben javítja.

Kromatográfiás kifejezések Retenciós idő: tR (minőségi jellemző) Holtidő: tm Csúcs felérték szélessége: wh Csúcsterület (A) (mennyiségi jellemző) Elméleti tányérszám (N, hatékonyság) N = 5,54 (tR/wh)2 Kapacitás arány(k) k = tR-tm/tm A csúcs Gaus görbe alakú

Kromatográfiás kifejezések Szelektívitás = tR2’/ tR1’ Felbontás Rs = 1,177 (tR1-tR2)/(Wh1+Wh2) Rs : 1,5 alapvonal felbontás

Kromatográfiás folyamat Kromatográfia elválasztási módszer. Kromatográfiában az állófázis és a mozgófázis között megoszlanak az anyagok megoszlanak egyensúlyi állandójuk szerint. A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a beinjektálási ponttól a detektorig jut. Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később eluálódnak mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.

Egy anyag megoszlása két egymással nem elegyedő fázis között Kd = Cm/Cst = p/q E = KdV/(1 +KdV) Where Kd: megoszlási állandó C m: anyag koncentrációja a mozgófázisban Cst : anyag koncentrációja az állófázisban E: extrakciós arány V: fázis arány Két anyagot akkor lehet elválasztani ha megoszlási állandójuk nem egyenlő (Kdx ≠ Kdy).

Kromatográfiás kifejezések Kd = k * β = k (Vm/Vst) Kd: megoszlási állandó β: fázis arány Vm: mozgófázis térfogata Vst: állófázis térfogata Egy anyag mennyisége a különböző fázisokban függ a megoszlási állandótól és a fázisok mennyiségétől.

Kövek a folyóban Kis kövek Víz áramlás (mozgó fázis) Nehéz kövek Meder Víz áramlás (mozgó fázis) Nehéz kövek (álló fázis)

Két anyag elválasztása a kromatográfia alatt a lépcsős modell alapján

Minta megoszlása a mozgó és az állófázis között K = q/p K:egyensúlyi állandó q: anyag koncentrációja az állófázisban p: anyag koncentrációja a mozgófázisban r: lépések száma

A minta eloszlása a mozgófázisban a kromatografálás folyamán

Anyagok elválása kromatografálás alatt K▲ < K■ < K●

Kromatográfia folyamata Koncentráció Idő Oszlophossz

A kromatográfiás csúcsok szélesedése a kromatográfia során A csúcsok az analízis során egyre szélesednek: Az állófázisban lévő anyag lemarad a mozgófázisban lévőtől, mert a fázisból ki és a befelé diffúzió lassúbb mint a mozgófázis sebessége. Az mozgó és az állófázisban a keresztirányú diffúzió időigényes. Az áramlás nem egyforma az oszlopon. A rosszul öblített helyekről az anyagcsere lassú.

Egy csúcs megoszlása az állófázis és mozgófázis között folyamatos modellben Az állófázisban lévő anyag lemarad a mozgófázisban lévőtől az anyagátadási ellenállás miatt, ezért e csúcsok egyre szélesebbek lesznek.

A csúcsok szélesedése a keresztirányú diffúzió lassúsága miatt Az anyag kromatográfia során egyre szélesebb tartományt foglal el a diffúzió és az egyenlőtlen áramlás miatt.

Csúcsszélesedés az áramlás egyenlőtlensége miatt Az oszlop különböző részein az minta más sebességgel halad.

Csúcsok szélesedése a rosszul öblített tartományban lévő lassú diffúzió miatt. A diffúzió sokkal lassabb mint a konvekció.

Kromatográfia célja A vizsgálandó komponens a többi anyagtól váljon el és minél jobb jel-zaj viszony mellett legyen meghatározható, minnél rövidebb idő alatt. A jó elválasztás kompromisszumok eredménye. A csúcsok hegyessége adja a jó jel-zaj viszonyt és a jó felbontást. A szelektivitás adja a zavaró komponensektől való eltérő retenciót. A kapacitás arány mutatja az elválasztó erőt.

Felbontás függése k, n és  értékétől P. Sandra JHRC 12 (1989) 82.

A felbontás javításának lehetőségei Hatékonyság javítása Hosszabb oszlop Kisebb oszlopátmérő vagy szemcseméret Vékonyabb állófázis Optimalizált áramlás Nagyobb kapacitás arány (3-10) Vastagabb, erősebb állófázis Gyengébb mozgófázis (HPLC) Alacsonyabb analízis hőmérséklet (GC) Lassúbb program Nagyobb szelektivitás Szelektívebb álló és mozgófázis Alacsonyabb hőmérséklet Származékképzés

Hatékonyság kisebb oszlopátmérővel vagy kisebb szemcseátmérővel növekszik GC Chirasil-Dex 10 m

Oszlophossz hatása Hosszabb oszlopon jobb felbontás, de hosszabb analízisek

Keskenyebb csúcsokkal (nagyobb hatékonyság) jobb az elválás A kapillárisok kisebb áramlási ellenállása miatt sokkal hosszabb oszlopokat használatát teszi lehetővé, ami nagyobb hatékonyságot és ezért jobb felbontást biztosít.

Van Deemter egyenlet mutatja az áramlási sebesség és a hatékonyság összefüggését HETP: high equivalent theoretical plate, L: oszlop hossz HETP: N/L () HETP =A +B/u + Cu A=Eddy Diffusion, B =Molecular Diffusion, C =Resistance to mass transfer, U =Linear velocity of gas(cm/s)

Kapacitás arány növelése állófázis filmvastagságának növeléséével Vastag filmvastagságú oszlopokat illékony komponensek (benzin, formaldehid, VOC) analízisére használjuk.

Oldószererősség hatása fordított (C18) HPLCs állófázison Az oldószererősség (mozgó fázis) csökkenésével nő a retenció, kapacitásarány és a felbontás.

Szelektivitás növelése alacsonyabb hőmérséklettel

A szelektivitás függése a hőmérséklettől = tR2’/ tR1’ ln α = Δ(ΔS0)/R- Δ(ΔH0)/RT α: szelektivitás S: entropia H: entalpia R: gáz állandó T: abszolult hőmérséklet

Szelektivitás növelése származékképzéssel GC Oszlop: 10 m x 0.1 mm CSP: Chirasil-Dex Vivő gáz: H2 Hőmérséklet: 180C Ebben az esetben a gyűrűs származéknak a legnagyobb a szelektivitása a merev szerkezet miatt.

Szelektivitás változtatása az állófázissal

Izokratikus vagy izoterm körülmények között a hatékonyság azonos a kromatogram egész hosszán A hatékonyság a rendszert jellemzi.

Felbontási értékek

Felbontás csúcsarány összefüggés eltérő nagyságú csúcsoknál Több nagyságrend eltérést mutató csúcsok jó elválásához legalább Rs 2,5 érték kell.

A „kis csúcs elöl” gyakorlat fontos a nyomnyi szennyezések megállapításánál GC Nem csak a szórás, de az abszolult érték is más. Ok a tailing, ami a csatlakozás és adszorpciós helyek. A: 20 m x 0,2 mm, ChNEB, 160° C. B: 20 m x 0,2 mm, ChDA, 150° C.

Csúcstorzulások is rontjál az elválást

A csúcsok asszimetriájának mértéke

Mennyiségi értékelés alapjai Kromatográfiában a mennyiségi értékelés alapja a csúcsterület. Egy csúcs területét az időközönként vett jelek összege adja. Paraméterek: Treshold (nagyság meredekség) Meredekség Gyakoriság Alapvonal korrekció

Nem kellően elvált csúcsok területének meghatározása bizonytalan V.R. Meyer, Chromatographia 40 (1995) 15.

Asszimetrikus csúcsok hibás mennyiségi értékelést adhatnak

Mennyiségi értékelés a környezetvédelemben Környezetvédelmi mintáknál mindig kell kísérő standardot (surrogate standard) használni, hogy a minta-előkészítés során lévő veszteségeket kompenzáljuk. Az integrálás alapja a súlyarányok (standard/minta) arányában felvett csúcsterület arányok kalibráló sor (legalább 5 pont). A méréssorozatoknál a minták méréwse közben ellenőrizni kell a kalibráló sor stabilitását (minőségi kontrol. QC). Gyakran az injektálási standard is fontos.

Túlteterhelés Ha a minta mennyisége valamelyik fázisban eléri a telítési koncentrációt torzult csúcsok lesznek a kromatogramon. Túlterhelésből eredő hibák: Megváltozott retenciós idők Hibás csúcs terület számítás

Túlterhelés hatása

Túlterhelés következményei

Túlterhelés rontja az elválasztást

Kis mintamennyiség is túlterhelheti a kromatográfiás rendszert Oszlop: 10 m x 0.1 mm CSP: Chirasil-Dex Vivő gáz: H2 Hőmérséklet: 170C Származék: ciklikus dikarbonát GC Extrém eset, általában 1-2 nagyságrenddel jobb.

Oszlopátmérő (kapacitásarány) és a terhelhetőség összefüggése Szélesebb oszlopátmérő nagyobb terhelhetőséget, de kisebb felbontást ad.

Kromatográfia felosztása mozgófázis szerint Gázkromatográfia, (GC) Folyadékkromatográfia (LC), nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) Szuperkritikus oldószeres kromatográfia (SFC) Elektrokinetikus kromatográfia (EKC) kapilláris elektrokinetikus kromatográfia (CEC)

Kromatográfia felosztása oszlop szerint Töltetes oszlop kromatográfia Kapilláris oszlop kromatográfia Chip kromatográfia Vékonyréteg kromatográfia (TLC) Kromatográfia felosztása kölcsönhatások szerint Megoszlásos kromatográfia Adszorpciós kromatográfia Kizárásos, gél (exclusion) kromatográfia Ioncserés kromatográfia

Kromatográfiában leggyakrabban használt oszlopok jellemzői Tulajdonság Oszloptípus Kapilláris Töltetes Előny Nagy hatékonyság Terhelhetőség Oszlop hossz CE: 0,05 –0,5 m GC: 10- 100 m 0,05 – 0,5 m Rs> 1,5- höz szükséges  1,01-1,03 1,1-1,3 Alkalmazott állóf és mozgófázisok Kevésbé szelektív, gyors (ciklodextrinek) Nagy szelektivitású (cellulózok) Kromatográfiás mód GC, SFC, EKC HPLC, SFC, CEC

Kromatográfiás módok összehasonlítása

Különböző kölcsönhatási erők szerepe egyes kromatográfiás módokban Ideális kromatográfiás módok egyes anyagokra GC Könnyenilló, hőstabil vegyületek HPLC Poláros, nehezen illó, hőre bomló vegyületek CE Ionos vegyületek