XENOBIOTIKUMOK, ÉS EGYÉB NEHEZEN BONTHATÓ VEGYÜLETEK MIKROBIÁLIS LEBONTÁSA

XENOS = IDEGEN SZINTETIKUS = NEM TERMÉSZETES EREDETŰ Példák: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyes szerves vegyületek Lebontásukra megoldás: - fizikai - kémiai módszerek - biológiai Az 1960-as évek elején felfedezték, hogy számos talajlakó mikroorganizmus képes a xenobiotikumok bontására Egyféle szennyezés ritkán fordul elő, ált. vegyes hulladék sokféle enzim, mikroorg. szükséges Legproblémásabb vegyületek az aromás, valamint halogén elem tartalmú vegyületek, lebontásukra többek között az oxigenáz, dehalogenáz enzimek alkalmasak

LEBONTÁSI ÚTVONAL LEHET AEROB, ANAEROB aerob: mono- és dioxigenázok anaerob: reduktív folyamatok pl. dehalogenáció, Anoxiás körülmények aerob mikroorganizmusokkal (nitrát, szulfát jelenlétében)

Metabolikus utak Nap szervesanyag O2 Fototróf Kemotróf CO2 Ahhoz, hogy megértsük a mikrobiális lebontási útvonalakat, szükséges a mikroorganizmusok alapműködésének ismerete Metabolizmus = reakciók együttese, mely során a sejtek energiát és kémiai építőelemeket nyernek Energia nyerés szempontjából vannak fototrófok ill. kemotrófok Energia és szénforgalom a bioszférában Nap szervesanyag O2 Fototróf Kemotróf CO2 Hő, entrópia Hő, entrópia

részletek Makromolekulák Oligomerek Monomerek felvétel sejtbe Számos metabolikus út Szükséges elemek, vegyületek felvétele a környezetből (membrán transzport) glükózzal könnyen megy: glükóz prekurzorok építőelemek PO43- NH4+ SO42- fehérjék sejtfal nukleinsavak glükogén O2 Makromolekulák Oligomerek Monomerek felvétel sejtbe metabolizmus Depolimerizáló enzimek hidrolizis

Legfontosabb metabolikus utak TCA (trikarbonsav) ciklus esszenciális centrális metabolikus út Calvin ciklus XuMP, RuMP (xilulóz monofoszfát ill. ribulóz monofoszfát) EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) PPP (pentóz-foszfát) Nitrogén Kén

Aanerob metabolizmus benzoil-CoA-n keresztül Benzoil-CoA konverziója acetil-CoA-vá

Bakteriális lebontási útvonalak központi intermediereken keresztül

‘Biohozzáférés’ Egy kémiai komponensnek kapcsolatba kell lépnie a biológiai rendszerrel ahhoz, hogy bármilyen hatás indukálódjon Fizikai-, kémiai paraméterek befolyásolják: Vízoldhatóság nem vízoldékony (hidrofób) anyagok esetén ‘direkt’ felvétel – specifikus sejtfelszíni tulajdonságok Illékonyság Funkciós csoportok száma a vegyületen pl. klórozottsági fok környezeti faktorok

Alifás szénhidrogének mikrobiális bontása Alkánok, alkének, alkoholok, ketonok, éterek, epoxidok, észterek, karboxilsavak Számos formája természetes körülmények között is előfordul Ipari alkalmazás – oldószer, tisztítószer, intermedier, stb. Toxikus hatás, többségük egészségre ártalmas Sok aerob, CH bontó mikroorganizmus.. metán hasznosítók, Pseudomonasok, Rhodococcus -, Acinetobacter fajok, monooxigenáz támadással indul, NADH-t igényel, mint elektron donor. A beépülő oxigén molekuláris oxigénből származik

Példák n-alkán oxidáxió - Pseudomonas oleovorans Elágazó alifás CH-k bontása - Pseudomonas citronellolis

Éterek bontása

MTBE (metil tercier-butil éter) Izoprén bontása – Rhodococcus sp. MTBE (metil tercier-butil éter) Főleg talajvíz szennyező, adalékanyagként, oldószerként használják Propán hasznosító baktériumok kometabolizmussal bontják - Mycobacterium vaccae

Halogén tartalmú vegyületek Többségük ember alkotta vegyület Pl. oldószerek, vegytisztitószerek, peszticidek Vízben nem vagy nagyon rosszul oldhatók Ellenáll a mikrobiális lebontásnak Előnyös tulajdonságaik a visszájára fordultak Toxikusak Fő probléma, hogy nehezen hozzáférhetők Eltávolításukra megoldás: detergens alkalmazása a szennyezett talaj kiásása égetés biotechnológia

Bontás biotikus reduktív dehalogénezés oxigenolitikus dehalogénezés hidrolitikus dehalogénezés tiolitikus dehalogénezés dehalogénezés intramolekuláris szubsztitucióval Dehidrodehalogénezés hidrodehalogénezés abiotikus hidrolizis redukció oxidáció

Bár úgy tartjuk számon a klórozott vegyületeket, mint ellenálló molekulák, számos mikroorganizmus képes bontani megfelelő körülmények között Reakciók: 1. Reduktív dehalogénezés - a C-Cl kötés hidrogénnel v. elektronnal redukálható, miközben szénhidrogén és sósav keletkezik a) hidrogenolizis: b) „szomszéd” redukció v. dihaloelimináció:

2. Oxigenolitikus dehalogénezés - mono-, vagy dioxigenázok katalizálják - hosszúláncú haloalkánok, klórozott aromás vegyületek is a) monooxigenáz katalizálta reakció: b) dioxigenáz katalizálta reakció:

3. Hidrolitikus dehalogénezés - a kloridot vízből nyert hidroxil csoportra cseréli - halohidrolázok, főleg alifás vegyületeket (2-8 szénatomos) 4. Tiolitikus dehalogénezés - a reakcióban glutation vesz részt, melynek kén atomja cseréli le a klór atomot, a keltekező tioéter hidroxilálódik

5. Halogénmentesítés intramolekuláris szubsztitucióval - haloalkoholok esetén 6. Dehidrodehalogénezés - csak olyan vegyület esetén lehetséges, ahol a halogén atomot hordozó szénatomon hidrogén van 7. Hidrodehalogénezés - 3-klórakrilsav - hidratáz enzim katalizálta reakció víz jelenlétében

Alifás vegyületek: oldószerek, stb. fő talajszennyezők Alifás vegyületek: oldószerek, stb. fő talajszennyezők halometánok illékonyak ózonrombolók aerob talajbaktériumok – pl. Methylosinus sp.,Methylococcus sp. metán monooxigenáz, ammónium monooxigenáz Példák  diklórmetán lebontása aerob metilotrófokkal: Methylobacterium,Methylophilus – glutation függő dehalogenáz  tetraklórmetán – perzisztens CO2 CH3CO-SCoA acetát CCl4 hipotetikus út CHCl3 CH2Cl2 CH3Cl CH4

Növekedési szubsztrát TCE (triklóretilén) - nem ismert olyan baktérium, mely egyedüli szén-, és energiaforrásként hasznosítja - biodegradáció kometabolizmussal, oxigenáz reakció Növekedési szubsztrát CH4 Mindez a metanotróf baktériumban: CH4 NADH O2 Metán-monooxigenáz H2O NAD+ CH3OH Köztes metabolizmus szaporodás

 Hosszúláncú klórozott alkánok. - oxidatív reakcióval  Hosszúláncú klórozott alkánok - oxidatív reakcióval - széles spektrumú alkán monooxigenáz enzimet szintetizáló baktériummal, melynek érdekessége, hogy a klórozott szubsztráttal indukálható az enzim

 Hexaklórciklohexán (HCH) - inszekticid - izomerek ( HCH  Hexaklórciklohexán (HCH) - inszekticid - izomerek ( HCH lindán) - állati idegrendszerre is hat! - több ismert bontó szervezet Pseudomonas putida Sphingomonas paucimobilis

Haloaromások. - többféle aerob lebontási út lehet Haloaromások - többféle aerob lebontási út lehet a) először a halogén elem távozik, utána hasad a gyűrű b) először hasad a gyűrű - minél több a klór atom a gyűrűn annál valószínűbb az anaerob lebontás, ez esetben a reduktív delogénezés történik 1. Klórbenzolok a klóratomok számának emelkedésével csökken a vízoldékonyságuk illékonyak, lipofilek, toxikusak, akkumulálódnak aerob bontásuk pl. Pseudomonas sp.

- lebontásuk hasonló a klórbenzolokéhoz 2. Klórfenolok - lebontásuk hasonló a klórbenzolokéhoz pentaklórfenol (PCP) Na- sóját széles körben haszn., fa- és bőr tartósítás (gombák és baktériumok ellen) bontás főleg G- baktériumokkal, oxigenolitikus klór lehasítás PCP monooxigenáz 3. Fenoxialkánsavak - növények növekedésére ható vegyületek: herbicidek pl. 2,4-D, 2,4,5-T

- nagy kémiai stabilitás, alig old. vízben, kevésbé illékonyak 4. Poliklórozott bifenilek (PCB) - nagy kémiai stabilitás, alig old. vízben, kevésbé illékonyak - óriási mennyiségben gyártják - transzformátor folyadék, kenőanyag, hűtőfolyadék, de papír-, festék-, stb. gyártásban is használják 5. Poliklórozott dibenzodioxinok és dibenzofuránok - ált. égetés során melléktermék - extrém alacsony vízoldhatóság - aerob bontás pl. Sphingomonas sp RW1 dioxin dioxigenáz gombával pl. Phanerochaete sordida Először a klórozottsági fok csökken, majd e reakció megy végbe

Összefoglalva a haloaromás vegyületekről hallottakat A haloaromás vegyületek biológiai úton bonthatók Minden esetben hatásos tápanyagok és oxigén adagolása Nem minden esetben előnyös ‘külső’ mikroorganizmus hozzáadása Néha előfordul, hogy az átalakítás végterméke még toxikusabb Ha a lebontás kometabolizmussal megy szükséges egyéb szervesanyag bejuttatása, ez azonban in situ remediálás esetén nem kívánatos (nem megengedett)

Nitro- funkciós csoportot hordozó vegyületek mikrobiális bontása Természetben előfordulásuk ritka, főleg emberi tevékenység következménye Természetes eredetű vegyületek pl. azomycin, klóramfenikol, pirrolnitrin Nemcsak toxikus, de mutagén, karcinogén hatás is Főleg festék-, peszticid-gyártás és robbanóanyag-gyártás hulladékaként jelenik meg, a nitrotoluolok a robbanószerek pl. TNT építőelemei Mivel a nitro csoport könnyen konvertálódik, ált. az intermedierekkel találkozunk Parfümgyártásban is használják, egyes vegyületei pézsmaillatot árasztanak

Nitro funkciós csoportot hordozó vegyületek biodegradációja Perzisztenciájuk fő oka nitro funkciós csoportjuk, mely erősen elektronelszívó hatású, emiatt az aromás gyűrű elektronhiányos, így akadályozzák az oxigenolitikus reakciókat (az oxigenázok elektrofil támadása gátolt) bonthatóságukat befolyásoló egyéb tényezők – oldhatóságuk (biol. hozzáférés), szorpció/deszorpciós tul., koncentráció, kémiai természet Mono-, esetleg dinitro vegyületeknél lehetséges oxigenolitikus bontás (mivel a természetesen előforduló vegyületek ált. mononitro vegyületek, így az evolúció során egyes szervezetek képesek voltak adaptálódni, és felhasználni e vegyületeket)

- gombák, streptomycesek bontják Nitroalkánok - gombák, streptomycesek bontják - flavoenzimek (FAD prosztetikus csoport) pl. Fusarium oxysporum - nitroalkán oxidáz: R1-CH(NO2)-R2 + O2 + H2O R1-CO-R2 + HNO2 + H2O2 pl. Hansenula mrakii 2-nitropropán dioxigenáz: 2 CH3CH(NO2)CH3 + O2 2 CH3COCH3 + 2 HNO2 Megjegyzés: érdekes, hogy ebben az esetben a dioxigenáz az oxigén molekula két atomját két molekulába építi, ez más dioxigenázokra nem jellemző 2. Nitrát észterek (C-O-NO2) - természetben nincs, emberi alkotás - pl. glicerol trinitrát = nitroglicerin - bontás: alig van példa, nem specifikus enzimreakciót feltételzünk Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas sp. Enterobacter cloacae

- erősen mérgező anyagok 3. Nitroaromás vegyületek - erősen mérgező anyagok - gyógyszer és festékipar számára nélkülözhetelen kiindulási anyagok - bontásukra négy ismert mechanizmus: a) oxigén jelenlétében nitrit szabadul fel b) kezdeti redukció eredménye aromás amin, ami tovább bont c) nitro csoport teljes reduktiv eliminációja, nitrit szabadul fel d) nitro csop. részleges redukciója hidroxilaminná - pl. Pseudomonas, Nocardia, Ralstonia, Comamonas, Phanerochaete C-, és N forrásként szolgálhatnak, az anaerobok többsége csak aminokká redukálja (-ketoadipát)

TNT reduktív mikrobiális transzformációja Gyengén vízoldékony, toxikus, ellenáll az oxigenolitikus támadásnak Mikrobiális bontására konkrét bizonyíték nincs, de Pseudomonas savastanoi faj TNT denitrációt mutatott, de szaporodást nem tapasztaltak, azaz nem szénforrás anaerob körülm. között pl. szulfát redukálók N forrásként hasznosítják TNT = trinitrotoluol TAT = triaminotoluol nagyon reaktív, oxigén jelenlétében gyors auto- oxidáció és polimerizá- ció tört., valamint erősen kölcsönhat a talaj- komponensekkel, így a mikrobák számára nem hozzáférhető TNT TAT

A TNT és fontosabb metabolitjainak kapcsolata a talajjal (a vastagított szürke nyíl az irreverzibilis szorpciót jelöli, a beszínezett aromás gyűrű azokat a metabolitokat jelöli, melyeket azonosítottak a redukciós folyamatban). Rieger and Knackmuss (1995). talaj

Hipotetikus ábra: a TNT redukciója és kemiszorpciója a talaj szervesanyagaihoz anaerob/aerob kezelés után A TNT redukált metabolitjainak kovalens kötéseit sárgával jelölték, melyeket NMR vizsgálatokkal igazoltak (Lenke és mtsai 2000; Achtnich és mtsai 2000). Anaerob fázis Aerob fázis Kölcsönhatás a talaj mátrix anyagaival Kezdeti szorpció A folyamatos redukció kovalens kötésű származékokat generál Kemoszorpció amin-, amid-, és imin- kötéseken keresztül A szorbeálódott vegyületek a hidrolizis vagy a biológiai oxidáció hatására nem mobilizálódnak újra

TNT szennyezett talaj dekontaminálására fejlesztett eljárás  N2 O2 M 40 hét alatt 2,5 gTNT/kgtalaj konc. kb 95%-kal csökkent Mosó oldat tartály Szennyezett talaj tartály 2 3 3 4 1 Anoxiás bioreaktor Aerob bioreaktor Ülepítő fotoreaktor

Policiklikus aromás szénhidrogének (PAHs) A PAH-ok lipofil vegyületek, a fosszilis energiahordozók nem tökéletes égetésének melléktermékei Vízoldékonyságuk csekély mértékű, viszont szerves oldószerekben jól oldódnak megtalálhatók a levegőben, talajban, üledékekben, felszíni-, és talajvizekben A molekulák oxidációval, redukcióval szembeni ellenállóképessége, és illékonyságuk a molekulatömeg növekedésével együtt nő. Többségük karcinogén Hasznosításuk: főleg intermedier vegyületként a gyógyszeriparban, mezőgazdaságban, fotográfiában, hőrekeményedő műanyagok, kenőanyagok előállításában, a vegyiparban Kinyerése kőszénkátrány feldolgozás során, illetve kőolaj finomítási folyamatokból származó olajmaradékokból

PAH-ok szerkezeti formái, vízoldékonyságuk, karcinogenitásuk PAH-ok sorsa a környezetben

Eltávolításuk a környezetből Nem biológiai jellegű eltávolításuk: volatilizáció, fotooxidáció, kémiai oxidáció, adszorpció Mikrobiális lebontásuk gátolt a gyenge biohozzáférhetőség miatt, ami elsősorban gyenge vízoldékonyságuknak köszönhető Gram-, Gram+ baktériumok: Pseudomonas-ok, Sphingomonas-ok, Acinetobacter-ek, Rhodococcus-ok, Mycobacterium-ok…; gombák: Phanerochaete chrysosporium, Cunninghamella elegans…; algák: cianobaktériumok

PAH-ok mikrobiális lebontásának kezdeti oxidációs reakciói

PAH-ok anaerob biodegradációja Oxigénhiányos környezetben, denitrifikáló körülmények között bizonyított pl. a naftalin bontása Érdekes, hogy kevert PAH szubsztrátok esetén jobb hatékonyságú a biodegradáció, mint egyedi szubsztrát esetén A különböző redukáló körülményeket összehasonlítva, a legnagyobb mértékű degradáció szulfát redukáló körülmények között figyelhető meg, majd metanogén környezetben, és végül nitrát redukáló feltételek mellett