Mennyire különbözik két ember genomja? Genetikai polimorfizmusok és azok azonosításának alapelvei Dr. Rónai Zsolt Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet

A humán genom, genetikai polimorfizmusok két nem rokon személy genetikai állománya közötti különbség: 0,1% 3 000 000 bázispár variációs lehetőségek száma: 43 000 000 = 9,41 · 101 806 179

Genetikai polimorfizmusok „Mutáció” ritka allél < 1% betegség „Polimorfizmus” ritka allél > 1% jelleg, hajlam, tulajdonság Egyetlen bázisra kiterjedő variáció Hosszabb variábilis szakasz (ismétlődési polimorfizmusok) egypontos nukleotid polimorfizmus (SNP), pontmutáció, single nucleotide variation: 1 bázispár inzerció, deléció, szubsztitúció különböző hosszúságú szakaszok ismétlődése Itt beszélünk a polimorfizmusokról

Genetikai polimorfizmusok Ismétlődési polimorfizmusok Transzpozon eredetű ismétlődések long interspersed element (LINE) short interspersed element (SINE) retrovírus-szerű elemek hossz ismétlődés 6–8 kb 100–300 bp 3–11 kb 850 000 1 500 000 450 000 Szegmentális duplikáció 1–200 kb blokkok ismétlődése ugyanazon vagy másik kromoszómán Egyszerű direkt ismétlődések 1–13 bp hosszú szakasz: mikorszatelliták; trinukleotid ismétlődések 14–500 bp-os szakaszok: minszatelliták / VNTR-ek (variable number of tandem repeats)

Genetikai polimorfizmusok A „rövid szakaszt érintő” polimorfizmusok (SNP és VNTR) hatása SNP VNTR kódoló szakaszon nem kódoló szakaszon báziscsere: semmi AS-csere splicing nonsense ins / del: frame-shift 3-mal osztható: ismétlődő peptidszakasz 3-mal nem osztható: semmi / nem ismert / transzkripciós aktivitás / mRNS élettartam…

Genetikai polimorfizmusok A „rövid szakaszt érintő” polimorfizmusok (SNP és VNTR) hatása SNP VNTR kódoló szakaszon báziscsere: semmi AS-csere splicing nonsense ins / del: frame-shift 3-mal osztható: ismétlődő peptidszakasz 3-mal nem osztható: sarlósejtes anémia fruktóz intolerancia cisztikus fibrózis „0” vércsoport Huntington-betegség 21-hidroxiláz deficiencia

Genetikai polimorfizmusok A „rövid szakaszt érintő” polimorfizmusok (SNP és VNTR) hatása SNP VNTR nem kódoló szakaszon semmi / nem ismert / transzkripciós aktivitás / mRNS élettartam… öröklődő tulajdonság, hajlam bizonyos betegségekre

Polimorfizmusok vizsgálatának elve PCR: bázissorrendtől – genotípustól – függően különböző méretű és/vagy színű DNS-molekulákat hozunk létre, elektroforézis ill. fluoreszcens detektálás: egy speciális technikával az első lépés során keletkezett reakciótermékeket nagyság szerint elválasztjuk („sorba rendezzük”) és láthatóvá tesszük, méretüket leolvassuk, értékelés: a keletkezett termékek mérete alapján következtetünk a genotípusra, mivel az első reakció elvét ismerve tudjuk, hogy a különböző méretű fragmentumok mit jelentenek.

Polimeráz láncreakció minta: teljes genom minta bármely szövetből származhat DNS-dependens DNS polimeráz a lánc szintézisét elkezdeni nem tudja a megsokszorozni kívánt szakaszt primerekkel „kijelöljük”, a 3 000 000 000 bázispárnyi szakaszból 80–20 000 bp hosszú régiót amplifikálunk

Polimeráz láncreakció idő hőmérséklet Polimeráz láncreakció Reakció

Polimeráz láncreakció STOP 2. ciklus

Polimeráz láncreakció 3. ciklus

Polimeráz láncreakció 4. ciklus

Polimeráz láncreakció Ciklus n 1 2 3 4 5 10 20 30 DNS-szál 2n+1 8 16 32 64 2048 2097152 2147483648 ... Kívánt hosszú 2n+1 – 2(n+1) Hosszabb 2(n+1) Arány % 22 52 2026 2097110 2147483586 6 12 42 62 0,000 25,000 50,000 68,750 81,250 98,926 99,998 99,999997 Polimeráz láncreakció

Polimeráz láncreakció Reakció: elméleti és tényleges amplifikáció termék mennyisége elméleti tényleges ciklusszám

Elektroforézis

Elektroforézis: a detektálás Térben adott idő után hol van hagyományos agaróz gél-elektroforézis Időben adott helyen mikor van kapilláris-elektroforézis, elektroforetikus chip UV utófestés EtBr a gélben UV, lézer

PCR-optimalizálás Primertervezés: a „jó” primer specifikusan csak a kívánt helyre kötődik nem képez másodlagos szerkezeteket a mintához stabilan kötődik, Tm 53 °C, s a két primer Tm-ja között nincs nagy különbség, a GC : AT arány 53–63 % (ha ez az arány túl alacsony, akkor a primer nem kötődik stabilan a DNS-hez: az Tm alacsony lesz; ha a GC arány túl nagy, akkor erősebben kötődik a DNS egyéb, nem teljesen komplementer részeihez), a 3’ végen lévő 1–2 bázis G vagy C, mert így ez stabilan kötődik  jobb extenzió, a primer 3’ végén lévő 10 bázisból álló szekvencia nem komplementer 80%-osan a DNS más részével — ellenkező esetben, különösen, ha ez a szakasz GC-gazdag, akkor nem kívánt helyre is kötődni fog a primer.

PCR-optimalizálás Az anneálási hőmérséklet függése – gradiens PCR

Polimorfizmusok kimutatásának alapelve Egyetlen bázisra kiterjedő variáció Hosszabb variábilis szakasz (ismétlődési polimorfizmusok) egypontos nukleotid polimorfizmus (SNP), pontmutáció, single nucleotide variation: 1 bázispár inzerció, deléció, szubsztitúció különböző hosszúságú szakaszok ismétlődése Polimorfizmusok kimutatásának alapelve PCR + elektroforézis a hosszkülönbség közvetlenül kimutatható az egyes allélok hossza azonos a szekvencia eltérését hossz- különbséggé kell alakítani

Hosszúság-polimorfizmusok vizsgálata A DRD4 exon III 48 bp VNTR a z b e h t III. exon – G-fehérje 48 bp (16 AS) 2–10 ismétlődik

A DRD4 exon III 48 bp VNTR vizsgálata y M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1000 bp 700 bp 500 bp 300 bp 200 bp 2: 379 3: 427 4: 475 5: 523 6: 571 7: 619 8: 667 9: 715 10: 763

A DRD4 exon III 48 bp VNTR vizsgálata M 8 200 bp 300 bp 500 bp 700 bp 1000 bp 2 ismétlődés 3 ismétlődés „heteroduplex”: az egyik szál 2, a másik 3 A legkisebb elektroforetikus mobilitású termék:

Hosszúság-polimorfizmusok vizsgálata Az „allél-kiesés”: rövid termék preferenciális képződése N R P O H H2N N R P O H dGTP dITP

SNP-k vizsgálata Restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus (RFLP) –521CT 1. PCR Restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus (RFLP) Restrikciós endonukleáz II.: felismernek egy 4–8 bázispár hosszúságú szekvenciát, s a DNS-t ott elvágják. Fsp I: TGCGCA 2. RFLP –521T TGCGCA –521C CGCGCA hasított hasítatlan CC CT TT

SNP-k vizsgálata Allél-specifikus amplifikáció (ARMS: amplification refractory mutation system) 3’ 5’ STOP –521T DNS –521C DNS 3’ exonukleáz DNS-polimeráz 5’ exonukleáz

SNP-k vizsgálata Allél-specifikus amplifikáció (ARMS) C-specifikus reakció T-specifikus reakció CT CT P2 C-spec. P2 P2 T-spec. P2 Elválasztás eredménye C T C T C T külső allél-spec.

SNP-k vizsgálata Kétirányú allél-specifikus amplifikáció –521CT SNP C 235 bp –521T 405 bp –521C Elválasztás eredménye TT CT CC 605 bp 405 bp 235 bp

SNP-k vizsgálata MASA: multiplex allél-specifikus amplifikáció B C D P2 ASA ASB ASC ASD P2 Kísérlet eredménye abcd ABCD Genotípusok külső SNP A Aa BB CC dd SNP B SNP C SNP D

SNP-k vizsgálata Primerek az allél-specifikus amplifikációhoz primer pozíciója (3’ vége) adott ha nem kétirányú ASA, akkor a primer iránya változtatható Tm lehet magasabb néhány fokkal, mint a külső primereké főleg a primer hossza, és nem az olvadáspont a döntő – 20–22 bázisnál hosszabb primer mindenképp „elindul” dITP a reakcióelegyben segít kétirányú ASA esetében

SNP-k vizsgálata Luminex Alapelv: „flow cytometer” – sejtek helyett gyöngyök kettős lézeres detektálás: 1.: melyik gyöngy? 2.: mi van a gyöngyön?

SNP-k vizsgálata Eragen (Luminex) Multiplex SNP genotipizálás ASA + specifikus fluoreszcens jelölés iC:iG bázispárral + Luminex O H2N N N H N N N N H2 O N ribóz ribóz izocitidin izoguanozin 1. PCR iC iC iC iC

SNP-k vizsgálata Eragen (Luminex) 2. ASA allél-specifikus amplifikáció AS primer 5’ végén 8 bázisos szekvencia a Luminex gyöngy felismeréséhez iC biotin iG 3. 48 96 Luminex gyöngyök hozzáadása 1 32 80 16 64 biotin SNP 2 SNP 1 iG

SNP-k vizsgálata Eragen (Luminex) 4. Streptavidin–fluoreszcens festék komplex hozzáadása 64 biotin F streptavidin SNP 1 iG 5. Detektálás (Luminex) Lézer 1 Gyöngy 1 2 3 4 5 6 … 95 96 SNP 1 2 3 … 48 Lézer 2 64 32 lézer 1: gyöngy Lézer 2: allél 80 96

SNP-k vizsgálata Primerextenzió I. C/T SNP 1. T-allél kimutatása ? A A G T C A A G C T A G 1. T-allél kimutatása Reakcióelegy G T C T T G A A C G T jelölt primer + dCTP + dGTP + dTTP + jelöletlen ddATP G T C A G A A C T C A A G ? A A G T C A A G C T A G Termék primer G T C T T G A T G T C T T G A G T T C A C G T C T T G A G T T C G T T C A

méret = melyik allél, szín = melyik SNP (Seqenom MassEXTEND) SNP-k vizsgálata Primerextenzió I. C/T SNP G T C A G A A C T C A A G ? A A G T C A A G C T A G 1. C-allél kimutatása Reakcióelegy G T C T T G A A C G T jelölt primer + dCTP + dATP + dTTP + jelöletlen ddGTP G T C A G A A C T C A A G ? A A G T C A A G C T A G Termék primer G T C T T G A G T G T C T T G A G T T C A A A G C G T C T T G A G T T C G méret = melyik allél, szín = melyik SNP (Seqenom MassEXTEND)

méret = melyik SNP, szín = melyik allél (ABI SNaPshot) SNP-k vizsgálata Primerextenzió II. C/T SNP G T C A G A A C T C A A G ? A A G T C A A G C T A G Reakcióelegy G T C T T G A G T T C A C G T jelöletlen primer + 4 (min. 2) különböző színű ddNTP G T C A G A A C T C A A G ? A A G T C A A G C T A G Termék T G T C T T G A G T T C A C G T C T T G A G T T C G méret = melyik SNP, szín = melyik allél (ABI SNaPshot)

SNP-k vizsgálata SNPstream multiplex PE-n alapuló rendszer sok ember és/vagy sok SNP vizsgálatára egy vizsgálat: 4608 genotípus 1. 12-szeres PCR 2. 12 PE reakció SNP 1 SNP 2 SNP 12 … A B L A C G T A C G T A C G T 384-es tálca, minden pozíciója egy „4x4-es array” a megfelelő „tagekkel” + A B C + D E F + G H I – J K L pozíció színe: genotípus 12 hely: 12 SNP

Monogénes betegségek Trinukleotid ismétlődéssel járó betegségek Fragilis X-szindróma Huntington-kór Dystrophia myotonica Lokalizáció Xq23.7 4p16.3 19q13.3 Trinukleotid CGG CAG CTG DNS nem kódoló kódoló normális 6–54 11–24 5–37 kóros > 200 42–82 > 50 Fragilis X szindróma: második leggyakoribb mentális retardációt okozó öröklődő rendellenesség Dystrophia myotonica: dorsalis végtagizmok, arcizmok sorvadása, myotoniás reakció (relaxációs idő), szív, légzőizmok, GIR

Monogénes betegségek Huntington-betegség Kialakulás CAG ismétlődés  poly-Gln fehérjerész („huntingtin”) proteázok nem tudják lebontani késői megjelenésű neurodegeneratív elváltozás Öröklődés autoszomális domináns Tünetek 40–50 év körül, ritkábban előbb arc és a végtagok szabálytalan, rövid tartamú mozgásai személyiségváltozás, depresszió, demencia lefolyásának ideje 9–17 év

Monogénes betegségek Sarlósejtes anaemia Globin láncot kódoló gének: Haemoglobin A Haemoglobin S a-család: a1, a2, x (a1 és a2 gén terméke: a-lánc) b-család: e, Gg, Ag, d, b b1 a2 b1 a2 Egészséges felnőtt haemoglobin: 96% a2b2 (HbA) kis mennyiségben: a2d2 (HbA2) és a2g2 (HbF) a1 a1 b2 b2 Sarlósejtes anaemia: b-gén pont-mutációja  A–T bázis-csere  Glu–Val csere  „HbS”  megváltozott fel-színű molekula  másik b-lánccal össze tud kapcso-lódni.

Monogénes betegségek Sarlósejtes anaemia Diagnózis, tünetek: sarlósejtek kapilláriselzáródást okoz-nak: végtagfájdalmak, fekélyek, fe-mur, humerus asepticus necrosisa sarlósejtek akkumulációja a lépben  fertőzések elleni védekezés  tüdő: csökkent vérellátás  tüdő-gyulladás agy, máj, vese, pancreas hypoxiás károsodása preanatalis dg.: chorionboholy min-tavétel Homozigóta: letális (prenatalis dg.!) Heterozigóta: a vvs-ek kb. 1% károsodott, de: védelem malária ellen

Monogénes betegségek 21-hidroxiláz deficiencia (congenitalis adrenalis hyperplasia) nincs negatív feed back ACTH-szint magas tesztoszteron andosztendion koleszterin dehidroepiandrosztendion pregnenolon 17-OH-pregnenolon 3--dehidrogenáz 17-hidroxiláz 3--dehidrogenáz progeszteron 17-OH-progeszteron 21-hidroxiláz STOP 21-hidroxiláz 11-dezoxikortikoszteron 11-dezoxikortiozl 11--hidroxiláz 11--hidroxiláz kortikoszteron kortizol aldoszteron

Monogénes betegségek 21-hidroxiláz deficiencia (congenitalis adrenalis hyperplasia) Háttér: több pontmutáció (nonsense mutáció) ill. 8 bp del (pseudogén) Típusok: sóvesztő „szimpla” virilizáló nem klasszikus Tünetek: lányok „fiú(s)” külső nemi szervekkel születnek nemi érés fiúknál sem teljesen normális Megoldás: chorion boholy minta  prenatalis dg. (allél-specifikus PCR) in utero hormonkezelés

Monogénes betegségek 21-hidroxiláz deficiencia (congenitalis adrenalis hyperplasia) Mutációk vizsgálatának technikai nehézsége: a pseudogén az „RCCX” modul részeként a 6-os kromoszóma rövid karján normálisan is megtalálható RP1 C4 C4 C4 TNXB TNXA RP2 TNXA RP2 CYP21B Trimodular CYP21A CYP21A RP1 C4 C4 TNXB CYP21B TNXA RP2 Bimodular CYP21A RP1 C4 TNXB CYP21B Monomodular

Monogénes betegségek 21-hidroxiláz deficiencia (congenitalis adrenalis hyperplasia) Mutációk vizsgálatának technikai nehézsége: a pseudogén az „RCCX” modul részeként a 6-os kromoszóma rövid karján normálisan is megtalálható http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html aktív gén szelektív amplifikálása: deléció helyéről induló primerek alkalmazásával

inaktív 7,8-dihidrobiopterin Monogénes betegségek Fenilketonuria CH COO– +H3N CH2 OH Phe Tyr Phe-hidroxiláz O2 H2O dihidrobiopterin NADPH+H+ NADP+ dihidrobiopterin- reduktáz N HN C CH3 H O tetrahidrobiopterin dihidrofolát- inaktív 7,8-dihidrobiopterin minden újszülöttet szűrnek gyakori (1:9000) tünetek kialakulása jól csökkenthető klasszikus kofaktor defektusos hypothyreosis, galactosaemia, biotinidáz hiány dopamin, szerotonin, noradrenalin szintézis is károsodik

cysticus fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) fehérje Monogénes betegségek Cysticus fibrosis MSD1 MSD2 NH3+ NBD1 NBD2 R COO– cysticus fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) fehérje ioncsatorna a légutak, GIR, nyálmirigyek, urogenitalis rendszer mirigyeiben

Monogénes betegségek Cysticus fibrosis Leggyakoribb életet veszélyeztető genetikai betegség a fehérbőrű népességben 1:2500 autoszómális recesszív minden 25. személy hordozó elterjedésének oka: védelmet nyújt kolerával szemben leggyakoribb mutáció: F508, de több száz más mutációt azonosítottak már – legtöbb a NBD-ekben fehérje működőképes lenne, de az ERAD lebontja

Monogénes betegségek Cysticus fibrosis Tünetek: tüdő: köhögés, tüdőgyulladás GIR: bélelzáródás (meconium ileus), pancreas: exocrin: emésztési zavar, endocrin: diabetes mellitus verejtékmirigy: dg.: [Cl–] > 60 mM, a gyerek bőre „sós” Genetikai dg.: ismert mutációk: PCR (3 bp del), ASA, RFLP, stb. ismeretlen mutációk: pl. szekvenálás, SSCP prenatalis dg. csak ha már született egy beteg gyerek a csalásban, sok mutáció miatt a szűrés nem megvalósítható (egyelőre) Kezelés: szupportív: tünetek enyhítése génterápia: a CFTR gént tartalmazó adenovírussal

Kapilláris-elektroforézis Analitikai alkalmazások (DNS) PMT detektor szűrők lézer / UV szűrők – + kettőstörő tükör PMT lencse kapilláris puffer minta puffer lézerek Analitikai alkalmazások (DNS) ssDNS elválasztás: primerek tisztaságának ellenőrzése, SNP-analízis (primerextenzió) dsDNS analízis: PCR-fragmentum analízis, (szekvenálás) Mikropreparatív felhasználás (DNS) frakciógyűjtés

Kapilláris-elektroforézis Mikroszatellita polimorfizmusok vizsgálata DNS-ujjlenyomat linkage analysis, teljes genome scan, genom kontroll trinukleotid ismétlődéssel járó betegségek 5x 6x 4x K1 K2 heteroduplexek 1x 9x 1x / 8x 4x / 9x 4x / 5x 5x / 6x 3x / 8x 1x / 7x 30 34 38 42 46 perc

Kapilláris-elektroforézis „DNS-ujjlenyomat”: apasági vizsgálat STR: Short Tandem Repeat (mikroszatellita): 2–7 bp hosszúságú ismétlődési polimorfizmus nem kódoló génszakaszban A lókusz B lókusz C lókusz Polimorfizmus A lókusz B lókusz C lókusz Ismétlődési szám 2–11 20–40 8–27 Variáció 10 21 20 102 · 212 · 202 2 Kombinációs lehetőség: = 8 820 000

Kapilláris-elektroforézis „DNS-ujjlenyomat”: apasági vizsgálat STR: Short Tandem Repeat (mikroszatellita): 2–7 bp hosszúságú ismétlődési polimorfizmus nem kódoló génszakaszban A lókusz B lókusz C lókusz Anya Gyerek Férfi 1 Férfi 2 bp

Komplex jellegek genetikai háttere Multifaktoriális: genetikai + környezeti jellegek „C” gén „B” gén „D” gén „A” gén „E” gén jelleg környezet szív- és érrendszeri betegségek, daganatok, személyiség jegyek, pszichiátriai rendellenességek „Klasszikus genetikai” vizsgálatok egypetéjű ikrek, családvizsgálatok, örökbefogadottak vizsgálata számos nem monogénes betegség is családi halmozódást mutat

Komplex jellegek genetikai háttere Asszociáció vizsgálat A jelleg kialakításában szerepet játszó gének azonosítása „Linkage analysis” családfák vizsgálata Asszociáció vizsgálat populációk vizsgálata kiválasztott genetikai „markerek” teljes genom scan: mikro- szatelliták anatómiai, élettani „megfontolás” megfelelő kromoszóma- szakasz azonosítása kandidáns gén és polimorfizmusai

Komplex jellegek genetikai háttere Genetikai kapcsoltság: linkage equilibrium / disequilibrium Aa Bb pl.: ha A = 80%, a = 20% ill. B = 75%, b = 25%, akkor a várható együttes előfordulási gyakoriságok: A B A b a B a b 60% 20% 15% 5% ha ez valóban így van: linkage equilibrium, ha nem: linkage disequilibrium (LD) Két lókusz kapcsolt öröklődése: milyen gyakran történik rekombináció a polimorf helyek között

Komplex jellegek genetikai háttere Haplotípus A B A b a B a b a polimorf allélok relatív kromoszómális elrendeződése Meghatározása: családok genotípus adatai alapján számítógépes algoritmusokkal „direkt molekuláris”: PCR-módszerekkel

Komplex jellegek genetikai háttere A DRD4 gén polimorfizmusainak LD-analízise –616CG –615AG –521CT 120 bp dup +1 48 bp VNTR 5’ nem kódoló exon I II III IV  –521CT –615AG –616CG 120 bp dup 0,0013 0,0922 0,0248 –616CG 0,1488 0,4021 –615AG 0,1859 D = pAB – pA·pB 2 = D2 PAPBPaPb

Komplex jellegek genetikai háttere genetikai asszociáció vizsgálat A jelleg kialakításában szerepet játszó gének azonosítása genetikai asszociáció vizsgálat kiválasztott gének polimorfizmusainak vizsgálata kiválasztott jellegek (fenotípus) vizsgálata statisztikai elemzés

Komplex jellegek genetikai háttere Eset–kontroll vizsgálat azt vizsgáljuk, hogy az „eset” és a kontroll populációban a kandidáns gén polimorfizmusainak allélfrek-vanciája statisztikailag eltér-e egy-mástól p p AA Aa aa AA Aa aa Család-vizsgálat azt vizsgáljuk, hogy az „érintett” gyerekek „gyakrabban kapják-e” szüleiktől a kandidáns gén vala-melyik allélját (fordított logika) Aa Aa

Komplex jellegek genetikai háttere Eset–kontroll vizsgálat Tényleges Várható Geno 1 24 32 56 Geno 2 96 68 164  120 100 220 Geno 1 Geno 2 kontroll eset  kontroll eset 56/220120 164/220120 56/220100 164/220100

Komplex jellegek genetikai háttere Eset–kontroll vizsgálat Tényleges Várható Geno 1 24 32 56 Geno 2 96 68 164  120 100 220 Geno 1 30,5 25,5 Geno 2 89,5 74,5 kontroll eset  kontroll eset (tényleges – várható)2 várható (24–30,5)2 30,5 (96–89,5)2 89,5 (96–89,5)2 89,5 (96–89,5)2 89,5 2 = = + + + 2 = 4,14 szabadsági fok = 1 p = 0,042 p < 0,1: tendencia p < 0,05: szignifikáns hatás

Komplex jellegek genetikai háttere Eset–kontroll vizsgálat Az Excel 2 próbája

Komplex jellegek genetikai háttere nem a DRD4 „hosszú allél” felel a … Eset–kontroll vizsgálat: populáció stratifikáció DRD4 exon III 48 bp VNTR „hosszú allél” (7) allél gyakorisága: kínai populáció: < 0,5% európai populáció: 19,5% nem a DRD4 „hosszú allél” felel a …

Komplex jellegek genetikai háttere Allél-átadás vizsgálata (Transmission Disequilibrium Test) Aa Aa ha egy kandidáns gén egyik allélja valamilyen jelleget okoz, akkor azokon a gyerekeken, akik szüleiktől ezt az allélt kapják, az adott jelleg megfigyelhető, ha egy csoport adott jelleget hordozó gyermeket megvizsgálunk, akkor statisztikailag azt figyelhetjük meg, hogy ők „gyakrabban kapták” a kandidáns allélt szüleiktől (…ezért hordozzák a jelleget)

Komplex jellegek genetikai háttere Allél-átadás vizsgálata (Transmission Disequilibrium Test) Nem átadott allél 1 allél 2 (b–c)2 a homozigóta szülő nem választ b heterozigóta szülő átadta TDT2 = allél 1 b+c Átadott c heterozigóta szülő nem adta d homozigóta szülő nem választ szabadsági fok = 1 allél 2 csak heterozigóta szülők vehetők figyelembe „transmission distorsion”: ha lehet, jelleget nem hordozókat is érdemes vizsgálni

Real-time PCR Alapelv Alkalmazások a PCR-termék képződésével arányos intenzitású fluoreszcencia keletkezik, amit a gép folyamatosan detektál exponenciális fázisban: arányos a kiindulási DNS mennyiséggel nincs PCR-t követő elektroforetikus analízis Alkalmazások génexpresszió vizsgálata genomban többször előforduló gének számlálása („gene dosage”) SNP genotipizálás új polimorfizmusok kimutatása (Light Cycler)

Real-time PCR Detektálás a keletkező összes PCR-terméket (nem specifikus) szekvencia specifikus: 5’ nukleáz (pl. TaqMan) Q 5’ 3’ R : riporter : quencher 1 3 2 SYBR Green: dsDNS interkalátor

Real-time PCR Mennyiségi mérés: a „threshold” ciklus Rn lgRn CT CT küszöb („threshold”) küszöb („threshold”) MHC08_G4 ciklusszám ciklusszám CT CT threshold: exponenciális fázisban threshold ciklus: hányadik ciklusban lépi át az adott minta fluoreszcenciája ezt a szintet – kiindulási DNS-mennyiséggel arányos

Real-time PCR Detektálás a reakció után: SNP genotipizálás T C FAM VIC Q F Q egy reakció tartalmazza a két allélra specifikus próbát különböző színű festékkel megjelölve CC VIC FAM CT (–) kontroll TT

eltérő szekvenciájú DNS-szakaszok olvadáspontja különbözik Real-time PCR Detektálás a reakció után: olvadáspont analízis eltérő szekvenciájú DNS-szakaszok olvadáspontja különbözik lassú felmelegítés Tm: két szál elválik SYBR Green jel 

DNS-chip Gén-chip / hibridizációs chip Elektroforetikus chip elektroforézis miniatürizált kapilláris elektroforézis szekvencia analízis (minőségi / mennyiségi) és: csatornák (és más elemek) szervzett 3D hálózata

Elektroforetikus mikrochip A rendszer felépítése 250 1650 250 chip áramforrás mikroszkóp objektív szűrők tükör tükör detektor lézer

Elektroforetikus mikrochip: alkalmazás A miniatürizálás előnyei anyag-, költség-, helyigény csökkentése, kis súlyú, kompakt eszközök, pontosan szabályozható körülmények, nagy hőmérséklet- és koncentráció gradiensek, nagyon kis időállandók (kis térfogat, nagy sebesség), hatékony hőátadás kisebb energia- és anyagfelhasználás, kevesebb hulladék, jól definiált áramlási viszonyok egyszerűbb és megbízhatóbb tervezés Egy kísérlet… RFU idő 30 60 90 sec

Elektroforetikus mikrochip Szilárd felület: üveglap 1D  2D váltás Kereszteződés ill. elágazás

Elektroforetikus mikrochip frakciógyűjtés reakció az elválasztás előtt multiplex rendszer

Elektroforetikus mikrochip Lab-on-a-chip / µTAS: RFLP a chipen Hae III restrikciós endonukleázzal emésztett FX 174 plazmid DNS elválasztása Emésztés a „mintatartályban” 1353 1078 0,2 RFU 872 271 281 134 234 603 118 72 310 1,0 1,5 perc