Foszfolipid-zsírsav meghatározás (PLFA) Készítette: Domiter Péter Csaba

Foszfolipidek A foszfolipidek az összetett lipidek csoportjába tartoznak. Bennük glicerin, karbonsav (zsírsav) illetve foszforsav kapcsolódik össze. A foszfátcsoporthoz a glicerin mellett különböző csoportok kapcsolódhatnak (további glicerin, etanolamin, kolin, szerin) A különböző csoportok miatt a foszfatidok egyszerre rendelkeznek poláris illetve apoláris résszel is, ezért képesek kapcsolódni poláris/apoláris felületekhez. Vizes közegben hártyát vagy membránt képeznek (pl. a biológiai membránok fő alkotórészeit is a foszfolipidek jelentik)

Foszfolipidek a talajban A foszfolipidek a mikróbák tápanyag-raktározó képződményeiben nem, csak a sejtek membránjában találhatóak meg. A talaj foszfolipidtartalma arányos a sejtfelülettel, azaz a biomassza tömegével. A foszfolipidek mennyiségét meghatározhatjuk foszfolipid-foszfát (L-PO4-) illetve foszfolipid-zsírsav (PLFA) módszerrel.

Mire használható a PLFA módszer? A módszer alkalmas az egyes talajremediációs technológiák tesztelésére illetve későbbi monitorozására. A talaj által adott válaszreakciók nyomonkövetésére egy-egy beavatkozást követően. A módszer által jobban megismerhető a talaj természetes illetve a mesterségesen előidézett öntisztulási folyamata.

A módszer elve A talaj foszfolipidtartalmának meghatározására a Bligh és Dyer (1959) féle extrakciós eljárást használjuk, amit egy átészteresítés követ. Ezt követően az eltérő szerkezetű zsírsavakat elválasztjuk egy szilárd-fázisú extrakciós kolonnán (SPE) Majd utolsó lépésként beinjektáljuk a kapott mátrixot a GC/MS készülékbe A kapott adatokból elvégezhető a mennyiségi illetve minőségi meghatározás.

Felhasznált eszközök Gáz-kromatográf (GC) és tömegspektrométer (MS) Kapilláris-kolonna (50m x 0,2 mm, 0,33 mm filmvastagság), amely be van vonva egy térhálos, 5% metilfenil-szilikon réteggel Rotációs bepárló Minta-koncentrátor (nitrogén segédgázzal) Centrifuga, 12 ml centrifugacsövekkel Vízszintes-rázató, 1l-es, kerekfenekű lombikkal Mechanikus-rázató Vízfürdő Szűrőtölcsér Elválasztó tölcsér

Felhasznált vegyszerek és reagensek I. Foszfát-puffer 8,7 g K2HPO4-et feloldunk 800 ml desztillált vízben, majd a pH-t beállítjuk 7,4-esre 1 M HCl oldat segítségével, végül az egészet feltöltjük 1000 ml-ig desztillált vízzel Az enyhén lúgos metanolízis (szappanosítás) reagensei Metanol: toluol elegy (1:1 v/v) 0,2 M KOH kloroformmal frissen elkészítve 1 mol ecetsav A nem szappanosítható komponensek savas metilációjának reagensei Metanol: kloroform: HCl (37%) (10:1:1) 2% NaCl Hexán: toluol elegy (1:1 v/v)

Felhasznált vegyszerek és reagensek II. TMSi származékképzés reagensei Dimetil-diszulfid (C2H6S2) Nátrium-tioszulfát (Na2S2O3) Jódoldat SPE kolonnán történő elválasztás SI kolonna: kloroform, metanol NH2 kolonna: kloroform, hexán, diklórmetán, etil-acetát SCX: kolonna: diklórmetán, acetonitril, aceton, ezüst-nitrát Celite 545 Na2SO4 (vízmentes) KOH Különböző zsírsav-metilészter standardok

Lipid extrakció Elvégezzük a lipidek extrakcióját a talajból a Bligh és Dyer (1959) módszer segítségével A talajmintákat belehelyezzük az 1l-es, kerekfenekű lombikba és hozzáadunk 200 ml 0,05 M foszfát-puffert. A következő lépés a víztartalom kivonása, majd ezután hozzáadunk 500 ml vízmentes metanolt és 250 ml kloroformot. A szuszpenziót élénken rázatjuk 2 órát, majd adagolunk bele 250 ml vizet és 250 ml kloroformot és további 24 órát rázatjuk, amíg szét nem válik. A szétvált fázisokat (kloroform, híg talaj oldat) dekantáljuk egy szűrőtölcséren keresztül (ebben található a Celite 545 réteg). A szerves fázist egy tölcséren keresztül elválasztjuk, majd szárítjuk nátrium-szulfát segítségével. A kloroformot eltávolítjuk párologtatással, úgy hogy 10 ml-t beállítunk és a frakciót -20 °C-on tároljuk.

Foszfolipidek elválasztása A lipid extraktumok elválasztása folyadék-kromatográfia segítségével történik Az elválasztáshoz kötött-fázisú kolonnát használunk (SPE Sl) Első lépésben kondícionáljuk a kolonnát kloroformmal Ezután elválasztjuk a semleges gliko- és foszfolipideket, ehhez egy oszloptérfogatnyi klorofomot, acetont és négy oszloptérfogatnyi metanolt használunk eluensként. A végül megmaradó fázis tekinthető a foszfolipid fázisnak, amelyet ezután alávetnek az enyhén lúgos metanolízisnek (szappanosításnak).

Szappanosítás Menete: A kloroform eltávolítása után maradt frakciót újraszuszpendáljuk metanol/toluol eleggyel Az így kapott szuszpenzióhoz 5 ml 0,2 M KOH oldatot adagolunk és 15 percen keresztül 37 °C-on inkubáljuk (a pH-t 6-osra állítjuk 1 M ecetsav oldat segítségével) Ezután hozzáadunk kloroformot és 10 ml desztillált vizet, majd a szuszpenziót 5 percen keresztül rázajtuk és utána centrifugáltatjuk. A zsírsav-metil-észterek és a nem szapanosítható foszfolipideket a szerves fázisban, a diacil-foszfolipidekből származtatott glicerin-foszfát észtert pedig a vízfázisban kapjuk vissza. Az extrakciót még kétszer elvégezzük A kapott három mintát Na2SO4 segítségével szárítjuk és bepárlón nagyjából 1 ml-re töményítjük.

Az eltérő zsírsav-metilészterek (FAME-k) szilárd-fázisú extrakciója I. A hidroxi-szubsztituált és a nem elszappanosítható zsírsav-metilészterek elkülönítése Az elválasztást SPE NH2 kolonnán végezzük el. Első lépésben a kolonnát kondícionálni kell diklórmetánnal és hexánnal. Ezt követően a mintánkat oldjuk kis mennyiségű hexán:diklórmetán (3:1 v/v) elegyben és elkezdjük adagolni a kolonnára. Elválasztjuk a nem hidroxi-szubsztituált és hidroxi-szubsztituált frakciókban levő FAME-ket, a nem szappanosítható fázisban levő nem metanolizált foszfolipidektől és szabad zsírsavaktól.

Az eltérő zsírsav-metilészterek (FAME-k) szilárd-fázisú extrakciója II. Ezüst-ion kromatográfia (A zsírsav-metilészterek elkülönítése a kettős kötések száma szerint) A szilárd-fázisú kolonnára felvitt ezüst-nitrát réteg feladata a szubsztituálatlan FAME-k elválasztása a telített (SATFA), egyszeresen telítetlen (MUFA) és többszörösen telítetlen (PUFA) frakcióktól (Christie, 1989.) Az eljárás szerint 20 mg ezüst-nitrátot acetonitril:víz (10:1 v/v) eleggyel felviszünk a kolonna falára. Az így előkészített kolonnát elárasztjuk acetonitrillel (2 térfogatrész), acetonnal (2 térfogatrész) és diklórmetánnal (4 térfogatrész). A FAME-ket oldjuk kis mennyiségű diklórmetán: hexán (7:3 v/v) elegyben és így juttatjuk a kolonnára. A SATFA frakciót ugyanebben az eluensben juttatjuk a kolonnára, a MUFA frakcióhoz diklórmetán:aceton (9:1 v/v), a PUFA frakcióhoz pedig aceton:acetonitril (9:1 v/v) eluenst használunk. Szabad áramlás mellett az oldószer keverékek gravitációsan elválnak, a frakciók pedig összegyűjthetőek lesznek.

Az eltérő zsírsav-metilészterek (FAME-k) szilárd-fázisú extrakciója III. A nem szappanosítható frakció kezelése (savas metilálás) Miután teljesen elpárologtattuk a vízfázist, a frakciót feloldjuk 2 ml metanol:kloroform:HCl (37%) (10:1:1) elegyben és 60 °C-on, lezárt üvegben tartjuk. A következő lépésben hozzáadunk 2 ml, 2%-os NaCl oldatot és 4 ml hexán:toluol elegyet (1:1 v/v), majd az egész frakciót centrifugáljuk. Ezt a lépést még három alkalommal elvégezzük. A szerves rész fogja tartalmazni a FAME-ket. A továbbiakban ugyanúgy járunk el, mint a hidroxi-szubsztituált és a nem elszappanosítható zsírsav-metilészterek elkülönítése során.

A minták előkészítése GC/MS injektálásra A SATFA frakció már készen áll az injektálásra, de a többi fració esetén szükség van valamilyen előkezelésre. Szilán származékok képződése: Az érzékenység növelése érdekében a zsírsavak OH csoportjait TMSi derivatizációval jelöljük (Parker, 1982). A FAME-k kezeljük 0,5 ml piridin:BSTFA:hexametil-diszilazán:trimetil-klórszilán [TMSi] (0,2:1:2:1 v/v) eleggyel (fontos, hogy az egyes reagenseket a megfelelő sorrendben adagoljuk a keverékhez). Ezután a a keveréket 60 °C-on melegítjük 15 percen keresztül. Majd az oldószert kihajtjuk nitrogén-árammal. A MUFA frakcióban lévő telítetlen kötések helyének meghatározása érdekében a frakciót dimetil-diszulfiddal kezeljük (Nichols, 1986.) A megmaradt egyszeresen telítetlen FAME-ket feloldjuk 0,05 ml hexánban, ezután DMDS-t (0,1 ml) és 1-2 csepp jódot adunk a rendszerhez és 72 órán keresztül 60 °C-on állni hagyjuk. A felesleg jódot eltávolítjuk 5%-os nátrium-tioszulfáttal, az elegyet pedig hexánnal extraháljuk (3 alkalommal megismételjük). Az így kapott hexán fázist egyesítjük és kiszárítjuk.

GC/MS meghatározás A különböző FAME frakciókat oldjuk 0,1 ml hexánban, ami belső standardot is tartalmaz. A végső oldat 1 mikroliterét injektáljuk a GC/MS-re a meghatározás érdekében. A megfelelő meghatározáshoz a GC/MS készüléken mind a SCAN, mind a SIM módot használjuk a mintánk elemzésére.

GC/MS működése A mintákat a kapilláris kolonnára (50 m x 0,2 mm, 033 mm filmvastagságú) injektáljuk. Az injektálást az automatikus mintaadagoló végzi splitless módban (a beadagolási idő 0,75 min) Hordozó-gázként héliumot használunk, az áramlási sebessége 0,25 ml/min A kemence hőmérséklete az első programban: Kezdetben 70 °C (2 percen keresztül tartja ezt az értéket) Elkezdjük emelni a hőmérsékletet egészen 160 °C-ig (40 °C/min) Majd tovább emeljük egészen 280 °C-ig (3 °C/min) A kemence hőmérséklete a második programban: 100 °C-ról 210 °C-ra emeljük a hőmérsékletet (50 °C/min) Majd egészen 300 °C-ig (3 °C/min) Ezeket a működésbeli változtatásokat azért csináljuk, hogy mérjük a MUFA frakció DMDS jelzett kötéseit. Az elektronsokszorozó feszültsége 1800-2000 V között változik. A GC/MS-t időközönként újrahangolni kell perfluor-tributilaminnal (ionizációs energiája 70 eV)

C=(Rf x k x m) / (Ri x A x MW) x 1000 , ahol: Számítás Egy reprezentatív minta tartalmazza mindazokat a FAME-ket, amiket bemutattunk, mint relatív standard. Ezt injektáljuk és mind SCAN, mind SIM módban elvégezzük a mérést. A FAME-k mennyiségét meghatározhatjuk a SCAN mód segítségével illetve a következő képlettel: C=(Rf x k x m) / (Ri x A x MW) x 1000 , ahol: C: a keresett vegyület mennyiség Rf és Ri: keresett és a standard vegyület főjele k: a keresett vegyület és a standard jelének különbsége alapján számolt faktor m: a beinjektált standard mennyisége (ng) A: a beinjektált talajextraktum mennyisége (mg) MW: molekulatömege a keresett komponens(ek)nek

Összegzés Idő spórolható meg, ha a talajminta csak kisebb mennyiségét vizsgáljuk (1 g) illetve, ha a FAME-k elválasztásának egyes lépéseit nem hajtjuk végre. Tömegspektrométer csak azonosításhoz szükséges, más vizsgálatokhoz elegendő a FID detektor is. A minimum detektálási limit: 5 ng/g A legnagyobb korrelációs koefficienst ebben az esetben kapjuk a különböző klasszikus biomassza meghatározási módok között (0,97) Hátránya: Eszközigényes Zsírátfedés

Forrásjegyzék Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 Uzinger Nikolett: Szennyezett talajok mikrobiológiai jellemzése és monitorozása a biomarkerek analízisével (www.taki.iif.hu/talajbio/plfa.ppt) www.taki.iif.hu/talajbio/preparalas.doc

Köszönöm a figyelmet!