ELVÁLASZTÁSTECHNIKA VI. ELEKTROFORÉZIS Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS ELEKTROMIGRÁCIÓ SZABAD HATÁRFELÜLETŰ (ZÓNA) GÉLELEKTROFORÉZIS DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS

Arne TISELIUS professzor

TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Tiselius (1925 – 1930) Szabad határfelületű (zóna) elektroforézis, 1948 Nobel-díj Elektroforézis hordozók bevezetése (1930 – 1950) - porok (cellulóz) - szűrőpapír - gélek (hidrolizált keményítő, agar-agar, agaróz, agaropektin) - membránok (cellulóz acetát) Poliakrilamid gélek (1950 – 1960) - pórusméret, molekulaszűrés, gradiens technikák - készülék fejlesztések (slab – disc, horizontális – vertikális) Detergens gélelektroforézis, SDS-PAGE (1960 – 1970) - Izoelektromos fokuszálás Kapilláris elektroforézis és kapcsolt technikák 1990 – től - CZE, CGE, MEKC, CIEF, CITP, ACE, CEC

AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI ELVÁLASZTÁS ELEKTROMOS ERŐTÉRBEN TÖLTÉSSEL RENDELKEZŐ MOLEKULÁK ELTÉRŐ ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁSA ALAPJÁN AZ ELVÁLASZTÁS TÉNYEZŐI AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR

AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG TULAJDONSÁGAI ELEKTROMOS TÖLTÉSSEL RENDELKEZZEN (POZITÍV, VAGY NEGATÍV, IZOELEKTROMOS PONT, pI), IONIZÁLHATÓ (INDUKÁLHATÓ), VAGY IONOS ÁLLAPOTBA HOZHATÓ (detergens micella) LEGYEN, KÉMIAI SZERKEZETE (stabilitás), FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI (disszociáció, erős – gyenge) KÖLCSÖNHATÁSAI (aggregáció, asszociáció) MÉRETE – TÖMEGE (kis molekulák – biopolimerek – fehérjék) ALAKJA (globuláris – fibrilláris) BELSŐ VISZKOZITÁS (konformáció) OLDÉKONYSÁG, DETEKTÁLHATÓSÁG, BIOLÓGIAI AKTIVITÁS

IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK A FEHÉRJÉK MOLEKULA SZERKEZETÉBEN

A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggése (eltérése) a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELVÁLASZTÁS KÖZEGE (HORDOZÓ) HALMAZÁLLAPOTA Folyadék (szabad határfelületű, vagy zónális), Szilárd (cellulóz – papír, szemcsék, membránok) Félfolyékony rendszerek (gélek, hidrofil polimerek) MINŐSÉGE Polaritás, dielektromos állandó, oldószer erősség, Viszkozitás, Hőmérséklet (hűtés !), ELEKTROKÉMIAI TULAJDONSÁGOK Ionerősség – ion minőség, pH (puffer)

AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

AZ ELEKTROFORÉZIS TECHNIKÁKBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT PUFFER RENDSZEREK pH tartomány Citrát (-dihidrogén, -hidrogén) 2 - 6,0 2,6 - 6,5 Dietil barbiturát (Veronál-Na) 7,0 - 10 Kálium hidrogén ftalát 2,2 - 6,5 Nátrium formiát 3,0 - 4,4 Nátrium acetát 4,2 - 5,4 Trietanolamin 6,7- 8,7 Nátrium borát 8,0 - 9,8 Ammónium acetát 8,6-9,8 Nátrium dihidrogén foszfát 2,0-6,0 és 8,0-12,0 Kálium dihidrogén foszfát 2,0-8,0 és 9,0-13,0 Bis-tris-propán 4.0 – 8.0

ELEKTROFORÉZIS AZ ELEKTROFORÉZIS KÖZEGÉNEK JELLEMZŐI IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol: ci az i-edik ion koncentrációja, zi2 az i-edik ion töltés számának négyzete.

E = V . d-1 (Volt /m) Q = f (I) V = R . I Ohm – törvény Joule - hő AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI AZ ELEKTROMOS ERŐTÉR JELLEGE – HOMOGENITÁSA Lineáris – radiális, síkban – térben, INTENZITÁSA E = V . d-1 (Volt /m) AZ ELEKTROMOS ÁRAMKÖR Ohm – törvény Joule - hő V = R . I Q = f (I)

= a molekula összetett paramétere, ~10-8 (előjel – irány) AZ ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETI ALAPJAI VÁNDORLÁSI SEBESSÉG () ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS ()  (Volt-1sec-1m2) t idő (sec) = a molekula összetett paramétere, ~10-8 (előjel – irány) „net charge” - eredő (össz) töltés, ionizáltsága (erössége-foka) anyagi minősége, hidrodinamikai ellenállása, közeg viszkozitása, ionerőssége-ion minősége, pH-ja, speciális vezetőképessége STOKES-féle törvény frikciós együttható (f) i = qi / 6r f = 6r

AZ ELEKTROFORÉZIS GYAKORLATA Analitikai – preparatív (oszlop, réteg) Horizontális - vertikális Disc - slab - kapilláris Kontinuus - diszkontinuus Detergens gélelektroforézis (SDS - PAGE) Moltömeg (méret) meghatározás Izoelektromos fókuszálás (IEF), pl

SZABAD HATÁRFELÜLETŰ „ZÓNA” (agaróz, dextrán, poliakril amid) Tiselius (1948) Nobel-díj SZABAD HATÁRFELÜLETŰ „ZÓNA” ELEKTROFORÉZIS HORIZONTÁLIS papír keményítő membrán (cellulóz acetát) GÉL (agaróz, dextrán, poliakril amid) ELEKTROFORÉZIS H

HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA „KLASSZIKUS” PAPÍRELEKTROFORÉZISSEL LDL HDL ( + )

HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM) CHYLOMICRON VLDL

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA ELFO VLDL LDL HDL UC

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN FESTÉS Sudan Black B

HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ÉS LIPIDEK ÖSSZEHASONLÍTÓ DIAGNOSZTIKAI VIZSGÁLATA

ELŐFESTETT EGÉR SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL VLDL LDL HDL

GÉLELEKTROFORÉZISSEL FEHÉRJÉK MOLEKULATÖMEG MEGHATÁROZÁSA VERTIKÁLIS (SLAB) PÓRUS-GRADIENS SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL LMW STANDARD FEHÉRJÉK

EHRLICH ASCITES TUMORSEJT MEMBRÁN FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA VERTIKÁLIS (DISC) SDS-POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZISSEL

DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS COOMASSIE BRILLANT BLUE HUMÁN SZÉRUM FEHÉRJÉK ÉS GLIKOPROTEINEK DETERGENS GÉLELEKTROFORÉZIS (SDS-PAGE) VIZSGÁLATA FESTÉS COOMASSIE BRILLANT BLUE PERJODÁT-SCHIFF (PAS) AGP

HUMÁN SZÉRUM AGP GENETIKAI VARIÁNSAINAK ELVÁLASZTÁSA IZOELEKTROMOS FOKUSZÁLÁSSAL (IEF GÉLELEKTROFORÉZIS) F1 S A O - 8990 O - 9130 L - 1328 NP - XXII pI 4,93 5,03 5,06

HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

LDH H ~ MÁJ (HEPAR) M ~ IZOM (MUSCLE) AZ LDH IZOENZIMEK TETRAMER SZERKEZETE ALEGYSÉGEK H ~ MÁJ (HEPAR) M ~ IZOM (MUSCLE)

LDH AZ LDH in situ KIMUTATÁSÁNAK SZINREAKCIÓJA TEJSAV + NAD PIROSZŐLŐSAV + NADH FENAZIN METOSZULFÁT NADH + TETRAZÓLIUMKÉK NAP + FORMAZÁN

KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK

KÜLÖNBÖZŐ KÓROS HUMÁN SZÉRUM LDH-IZOENZIM FELVÉTELEK DENZITOMETRIÁS KIÉRTÉKELÉSE