Labor beszámoló M2 csoport Elválasztás technika Labor beszámoló M2 csoport Bartus Zsuzsanna Fodor Melinda Mahunka Marietta Marosi Dóra Németh Viktória Szabados Ádám Szabó Dávid Takács Mónika Troczkis Fruzsina

HS-GC-MS

HS-GC-MS PerkinElmer HS-GC-MS Gőztéranalizátor (headspace) – mintaadagolás Gázkromatográf – elválasztás Tömegspektrométer - detektálás

Gőztéranalizátor (HS) - mintatartó Minta (folyadék, szilárd)- és Gázfázis közt egyensúly alakul ki Az egyensúly eltolódását a gőztér hőmérséklet változtatásával (termosztálás) tudjuk befolyásolni Egyensúly beállta után véges térfogatot bocsájtunk a gázkromatográfba

Kiegyensúlyozott nyomású mintaadagolás (balanced pressure) d=0,2-0,3 mm, kicsi holttértfogat, elhanyagolható zónaszélesítő hatás Minta térfogat nagysága a ∆p-től és adagolási időtől függ Zárt, minden részében jól termosztált rendszer Paraméterek könnyen kontrolálhatók, jól reprodukálható mérések

Gőztéranalizátor – beállítandó paraméterek és főbb hatásaik Gőztér hőmérséklete (max 400°C): megoszlási hányados Termosztálási idő: megoszlási hányados Tű hőmérséklet: kondenzálás Átvezető cső hőmérséklete: kondenzálás Nyomás alá helyezés ideje: mintatérfogat, kapilláris Injektálási idő: mintatérfogat

Gázkromatográfia Kromatográfia: fizika-kémiai elválasztási módszer, ahol az elválasztandó alkotók 2 fázis közt – álló és mozgó – oszlanak meg a különböző mértékű kötődéseik szerint Gázkromatográfia: gáz halmazállapotú mozgófázis Kolonna töltete/belső bevonata lehet az állófázis Gázok és gőz halmazállapotúra hozható folyadékok vizsgálatára alkalmas Az elválasztás nagyszámú szorpciós-deszorpciós lépésen keresztül történik Az elválasztás függ a vivő gáztól (Hidrogén, Nitrogén, Hélium) MS-nél Héliumot alkalmaznak a nagy ionizációs energiája miatt

Gázkromatográfia Két kolonna típus: Elválasztás befolyásolása: töltött kolonna: töltet lehet szilikagél, aktív szén, diatómaföld…stb., 2-4 mm belső átmérő, 0,3-3 m hossz kapilláris kolonna: belső folyadék film bevonat lehet metil-szilikon olaj, fenil-metil-szilikon olaj…stb., 0,10-0,53 mm belső átmérő, 15-75 m hossz Elválasztás befolyásolása: Termosztáló hőmérséklet Hőmérséklet egyenletes, lineáris változtatása Állófázis változtatása

Tömegspektroszkóp Mérés elve: ionos részecskéket választunk el fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint csökkentett nyomáson elektromos vagy mágneses mezők segítségével Mérjük az elválasztott ionok intenzitását Tömegspektrum (ujjlenyomat) Minőségi információ: legintenzívebb ion intenzitásra normált karakterisztikus tömegspektrum

Legfontosabb készülékelemek Mintabeviteli rendszerek (GC-MS) Ionforrás Analizátor Detektor Számítógép Vákuumrendszer Energiaellátó elektromos egységek

MS detektor

Előnyök összetett elegyek minőségi és mennyiségi elemzése rövid idő alatt (20-30 perc) elvégezhető, s igen kis mennyiségű alkotók (10-15-10-21 g) meghatározása lehetséges Minőségi,szerkezeti információ (hogyan?): Referencia anyagot kell használni a mérés során kapott tömegspektrum és ismert vegyületek, ismert tömegspektrumainak az összehasonlítása, a mérés során kapott tömegspektrum "megfejtése", ismert szabályok alapján történő értelmezése

Scanfunkciók Pásztázó: SID: az egész m/z tartományra történő ionintenzitás mérés A különböző m/z pontoknál mért intenzitások egymáshoz való arányát is lehet látni → minőségi információ Dinamikus üzemmód,pillanatnyi ionáramot mér,nagyobb hibával jár SID: Különböző, kevés m/z pontokban történő ionintenzitás mérés Legalább 2 pontban kell mérni Az adott mérések csak pár m/z pontra korlátozódnak, így a kérdéses ionokról sokkal pontosabb mérési eredményeket kapunk → mennyiségi információ Kimutatási határ 1 nagyságrenddel jobb

FID (lángionizációs detektor) kb. 2000-2500 K hőmérsékletű hidrogén-levegő láng A lángban a C-H kötéseket tartalmazó molekulák, azaz a szerves vegyületek (pl szerves savak) fragmentálódnak és egy részük ionizálódik Láng fölé helyezett elektródpár között gyenge áram folyik ionok képződésének hatására jel (feszültséget mér) (mintakomponens koncentrációjával arányos) Standardek használata

HS-GC mérésgyakorlat Mérés célja: Melaszban lévő karbonsavak vizsgálata. Vizsgált minták: C2, V2 Felhasznált vegyszerek: 85%-os foszforsav, NaCl (Merck, Darmstadt), több komponensű kereskedelmi standard (minden komponens 10 mmol/l)

Gőztéranalizátor (HS) paraméterei Minta hőmérséklete: 60 °C Tű hőmérséklete: 100 °C Átvezető cső hőmérséklete: 150 °C Termosztálási idő: 10 perc Nyomás alá helyezés ideje: 2 perc Injektálási idő: 0,05 perc Tű visszahúzás ideje: 0,5 min

Gázkromatográfiás készülék adatai Készülék: Perkin Elmer AutoSystem XL Detektor: FID Vivőgáz: N2, 110 kPa Adagoló: Perkin Elmer Headspace Sampler HS 40 Kolonna: VOCOL 60m x 0,53 mm x 3 μm Hőmérsékletprogram: 50 °C – ról 200 °C – ig 7 °C/perc sebességgel

A standardek és a minták előkészítése Légmentesen záródó 20 ml-es üvegedénybe bemértünk 2g NaCl-ot (kisózás), majd 1 ml foszforsavat adtunk hozzá. Erre mértük rá automata pipettával a standard/minta 1 ml-es részletét. Közvetlenül ezután az edényt gyorsan légmentesen lezártuk.

Standard kromatogramja

C2-es minta kromatogramja

V2-es minta kromatogramja

Mérési eredmények A C2-es mintában azonosított komponensek: propionsav, izovajsav, izovaleriánsav, izokapronsav, kapronsav A V2-es mintában azonosított komponensek: propionsav, izovajsav, vajsav, izovaleriánsav

GyorsLC

Kromatográfia általánosan Többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyűjtőneve. Közös elem: az elválasztandó komponensek az egymással érintkező két fázis között oszlanak meg, ezek közül az egyik áll, a másik pedig meghatározott irányba halad.

UHPLC (UPLC) HPLC p<400 bar Dp= 3-10 µm, porózus, nem porózus L= 15-25 cm; 3-8mm 5-200 µl UV-VIS 8x, 10x gyorsabb p›1200-1300 bar Dp‹2-3 µm; héjszerű szemcse L= 3-10 cm; 2-3 mm 0,1-0,5 µl minta térf. UV-VIS

Alapösszefüggések a kolonnán kívüli zónaszélesedésre optimált gyors LC és HPLC módszereknél Kis szemcseátmérő Kis térfogat (kisebb holttérfogat, kisebb komponens hígulás) Elemzési idő csökk.: L csökk., u növelése (k nem- interferencia veszély)  meg kell növelni p-t (Darcy)

Szemcse sérülése (UHPLC nagyobb nyomás) Kis η mozgófázis  acetonitril tartalmú (gradiens elúció, maximumos görbe) H csak kis mértében nőjön u-val (függ η) Készülék max nyomás  sebességnövelés határa Nagy nyomáshőhossz-, keresztirányú hőm.-grad. széles torzult csúcs (belső átmérő csökk.) belső átmérő csökk.Vr csökk. külső zónaszélesítő hatások

Kromatográfia kinetikus elmélete: van Deemter egyenlet: H- elméleti tányérszámmal ekvivalens oszlopmagasság, u-mozgófázis lineáris áramlási sebessége A: az oszlop geometriájának hatása (szemcsék közti tér nem teljesen rendezett) B: longitudinális diffúzió (molekula áramlik a szemcsék között) C: anyagátadással szembeni ellenállás

Kromatográfia kinetikus elmélete: Szemcseátmérő csökkentése: élesebb csúcs, rövidebb, kisebb átmérő

Kromatográfia kinetikus elmélete: Hőmérséklet növelésével:csökken a kölcsönható erők viszkozitása (mozgófázis), nő a mérendő komponens diffúziós állandója. B≈DM (molekuláris diffúziós állandó); C≈ (póruson belüli diffúziós állandó) Kis szemcsén belüli átmérő, a mozgófázis áll, csak a részecske diffúzióját vizsgáljuk.

Kromatográfia kinetikus elmélete: Nyomás növelése: a szemcseátmérő csökkentés velejárója, lamináris tartomány Héjszerkezetű állófázis: a diffúziós úthossz rövidebb, mint egy teljesen porózus szemcsénél. Kolonna ellenállását csökkenteni, mozgófázis gyorsabb, nem töltetes, hanem monolit kolonna esetén. Egy nagyságrenddel kisebb nyomás, mint a porózus töltet esetén. Könnyebben alakul ki nagyobb sebesség. Nyomástartomány és az oszlopon kívüli térfogat nagyon fontos.

UPLC készülék paraméterei Waters Acquity, Ascentis Express Peptide ES 10 cm x 3 mm; 2,7 µm (0,5 µm tömör belső) Gradiens elúció Eluens (30 % B-ig mentünk fel): A: víz+0,1 % TFA; B: acetonitril:víz+0,1 % TFA (= 90:10) U=0,8 ml/min, beinj.: 2 µl, Detektálás: λ=260 nm

Mérés kiértékelés Mennyi komponenst tud meghatározni? Pc=1+tg/wb (tg= 2.5 min alatt)  Pc= 41

Korlátok a gyors folyadékkromatográfiás módszereknél

Korlátok a gyors folyadékkromatográfiás módszereknél Azt vizsgáljuk, hogy milyen követelmények vannak műszer oldalról nézve az elemzés gyorsaságának növelésére. A kromatogramon mért zónaszélesedés két fő részből tevődik össze: Kolonna által okozott Kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások Adagoló okozta zónaszélesedés σ2A Összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö Detektorcella okozta zónaszélesedés σ2Dcell Detektor elektronika okozta zónaszélesedés σ2Dt σ2E = σ2A+σ2Ö+σ2Dcell+σ2Dt ∑σ2= σ2C+ σ2E

Az adagolóban és az összekötő vezetékben azért van zónaszélesedés, mert az áramlás lamináris és a sebességi profil parabolikus, az egyes rétegek közötti keveredés elhanyagolható. Azok a molekulák, amelyek a cső falához közelebb vannak kb fele sebességgel haladnak, mint a maximumban lévők => áramlási csúcsdiszperzió Ehhez hozzájárul a detektorban az áramlási sebesség megváltozása: ha lassú az elektronika, akkor nem lehetséges legalább 20 adatpont gyűjtése, amiből a kromatográfiás csúcs analóg jele leképezhető =>változik a görbe alatti terület és a zónaszélesség. A zónaszélesedés összege nem lehet nagyobb, mint a kolonnán mért tizede. σ2E=0,1σ2C

Példa UPLC: 5 cm hosszú, 2,1 mm belső átmérőjű kolonna, 1,7 µm szemcseátmérőjű töltet Kolonna okozta zónaszélesedés: σ2k=(πr2εT)2HL UPLC: σ2k=8,14 µm A komponens hígulása a kolonnán kicsi és a csúcskapacitás nagy, mert szűk a zóna, viszont a kolonnán kívüli zónaszélesedést meghatározza. A 10 %-os szabályt betartva a kolonnán kívüli zónaszélesedésnek 1 µl alatt kell lennie. Ez pedig több függetlenből tevődik össze, meg kell adni az egyes tagok járulékait: - megengedett legnagyobb injektált térfogat Vinj=105 nl - Detektor okozta zónaszélesedés és detektor térfogat σ 2det=20,8 µl - összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö=1,28 µl*1280 nl - detektor időállandó τRC=0,17 sec r=2,1 cm εT=0,5 Dp=1,7 µm H= 3,4 µm L=5 cm

Mintavételezési sebesség hatása a csúcskapacitásra és a felbontásra: a csúcskapacitás összefügg a kromatográfiás felbontással, így ha a csúcskapacitás csökken, csökken a felbontás is. Mintavételi sebesség Csúcskapacitás 80 Hz 40 Hz 20 Hz 10 Hz 5 Hz 61 56 44 28 16 HPLC A lassú mintavétel jelentősen csökkenti a kromatogramon látható csúcsok számát 80 Hz 40 Hz 20 Hz 10 Hz 5 Hz 2,25 2,05 1,71 1,17 0,67 UHPLC A gyors kolonnák nagy mintavételi frekvenciát igényelnek A kis belső átmérőjű és rövid kolonnákhoz a hagyományos HPLC rendszer nem, vagy csak nagy hatékonyság csökkenéssel alkalmazható.

Rövid kolonnák alkalmazása HPLC rendszerben: - 5 µl jelenti az adagolás felső határát - a minta oldószerének gyengébbnek kell lenni, mint a mozgófázis eluenserőssége - a molekuláris formának azonosnak kell lennie a mintában és a mozgófázisban - az összekötő vezetékek hosszát a készülék által megadott minimumra kell csökkenteni Adagoláskor a kolonna elején csúcskompresszió történik => gradienselúciót alkalmazunk akkor is, amikor nem lép fel az általános elúciós probléma. A kiindulási mozgófázis összetételének olyan gyengének kell lennie, hogy a minta leggyengébben visszatartott komponensének is nagyobb kell, hogy legyen a visszatartása, mint 10. Visszatartási tényező: K= KVs/Vm=ns/nm*Vs/Vm Vs, Vm: álló- és mozgófázis térfogata K: megoszlási hányados ns, nm: álló- és mozgófázisban mért mólok száma

k>10 A komponensek döntő részben az állófázisban tartózkodnak k>10 A komponensek döntő részben az állófázisban tartózkodnak. Az összes komponens vándorlási sebessége lecsökken, a mintaadagolás során a kolonna eleje koncentrálja azokat. Vándorlási sebesség [ux=u/(1+k)] csökken. k=10 Tizenegyed részére csökken a vándorlási sebesség, így a komponensek szűk zónában koncentrálódnak. Itt problémát okozhat az oldhatóság, ha a minta komponenseinek nagyon eltérő az apolaritása vagy polaritása. Ekkor a jobban visszatartott komponensek a gyenge eluenserősségű mozgófázisban kevésbé oldódnak. A közel egyforma tulajdonságú vegyületeknél a szelektivitás csökken.

Az elválasztást befolyásoló paraméterek hatásának vizsgálata

A kromatográfiás felbontás alapösszefüggése Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k) N az elméleti tányérszám (kinetikai hatékonyság), α a relatív retenció vagy szelektivitás (termodinamikai hatékonyság), k a visszatartási tényező. A kromatográfiás rendszerekben az elválasztás ezen három paramétertől függ.

Hogyan befolyásolja a paraméterek megváltoztatása az elválasztást? Deriváljuk az elválasztást megadó Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k) összefüggést, mindig az adott vizsgálandó paraméter (N, α, k) szerint.

1.) Elméleti tányérszám hatása ΔRs/ΔN = 1/8(N½)(α-1/α)(k/(k+1)) Egységnyi N változás  0,0144% elválasztás- változás. Ha a kolonnahosszat 2x-esére növeljük (pl. N = 3000- ről 6000-re)  az elválasztás értéke kb. 14%-kal nő (ha ua. a kolonna és változatlan a mozgófázis összetétele). Ez a hatás kismértékű, tehát a kolonnahossz növelése csak mérsékelten növeli az elválasztást. A nyomásesés a kolonnán közben kétszeresére nő. Ezek az adatok k = 2-3, α = 1,1 és ΔR = 1 körüli értékekre igazak.

Van Deemter  ha a szemcseátmérőt felére csökk Van Deemter  ha a szemcseátmérőt felére csökk.  az elméleti tányérmagasság is a felére csökken (Hmin és az Nmax)  N 2x-esére nő. A H-u görbe meredeksége annál kisebb, minél kisebb a szemcseátmérő (N-ben nagyobb lesz a nyereség). Ha 3 µm-ről 1,5 µm-re csökkentjük az állófázis szemcseátmérőjét, akkor pl. N=1000 2500-ra nő  kb. 26%-os növekedés az elválasztásban (ha az egyéb paramétereket változatlanul hagyjuk). A nyomásesés 4x-esére nő!

2.) Szelektivitás hatása ΔRs/Δα = ((N½)/4)(1/α2)(k/(k+1)) Egységnyi változás az α-ban  közel 1000-szeres változást okoz az elválasztási tényezőben. A szelektivitási tényező kismértékű változása nagymértékben növeli az elválasztást. Folyadékkromatográfiában vagy az állófázis típusát változtatjuk meg (állófázis hatás), vagy a mozgófázis összetételét (mozgófázis hatás). Ahhoz, hogy a mozgófázissal a megfelelő elválasztást tudjuk elérni, szükséges, hogy az állófázison minimális elválasztás elérhető legyen. A vegyületek szerkezetének függvényében, tehát az első feladat a legnagyobb szelektivitást nyújtó állófázis kiválasztása, csak utána következhet a mozgófázissal az elválasztás „finomhangolása”.

3.) Visszatartási tényező hatása ΔRs/Δk = ((N½)/4)((α-1)/α)(1/(1+k)2) Egy egységnyi változás k-ban  kb. 8% változást jelent a felbontásban. A deriváltnak maximum helye van a 2-3 k érték körül. Folyadékkromatográfiában a visszatartást az állófázis minőségével, a mozgófázis összetételével és a hőmérséklettel tudjuk változtatni.

Hőmérséklet Új elválasztást befolyásoló tényező, amely a technikai megvalósításban a legutóbbi években jelent meg.

Monolit kolonnák

Elemzési idő csökken, ha a lineáris áramlási sebesség nő! tr=L/u(1+k) Szemcsés tölteteknél a lineáris áramlási sebesség növelésével egyenes arányban nő a kolonnán a nyomásesés Ez monolit kolonnákra is igaz, viszont ezeknek az áramlási ellenállásuk sokkal kisebb, mivel porozitása a szemcsés töltethez képest sokkal nagyobb (a kolonna térfogatának 80%-a holttérfogat) Azaz ugyanolyan áramlási sebességhez sokkal kisebb nyomásesés tartozik (~ 1 nagyságrenddel)

Monolit töltet elektronmikroszkópos képe Vannak szilikagél és szerves polimer alapú monolitok. Szerves alapúnál a mikropórusosság elkerülhetetlen, ami szélesebb kromatográfiás csúcsot eredményez, valamint ezek mechanikailag kevésbé stabilak (biopolimerek elválasztására alkalmazzák). Fehér rész: szilikagél alapváz (benne 10-20 nm-es mezopórusok; visszatartást eredményezik) Sötét rész: nagy átmérőjű pórusok (1-2 μm; mozgófázis áramlás itt)

Az elválasztási ellenállás

Térfogatáramlási sebesség és nyomásesés a kolonnán Tehát nyomásesés szempontjából a monolit előnyösebb, mint a szemcsés. Az általánosan alkalmazott 1-2 ml/min térfogatáramlási sebességek 6-9 ml/min értékre növelhetők.

Előnyök és hátrányok Előnyök: Hátrányok: Térfogatáramlási sebesség növelhető Az elválasztás hatékonysága csak kis mértékben csökken gyors elválasztáskor Hagyományos készüléknél alkalmazható Gyors elválasztások közül ez adja a legkisebb elválasztási ellenállást Elemzési idő csökkenthető a térfogatáramlási seb. programozásával Hátrányok: A kolonna felületi kémiája korlátozott- elsődlegesen oktadecil és oktil módosított kolonnák kaphatók, és a normál fázisú kromatográfiában alkalmazott alap szilikagél Mivel műanyag házban van a töltet, így max. 200 bar nyomás alkalmazható

Köszönjük a figyelmet!