Mérési módszerek automatizálása, áramló oldatos  (FIA) technikák, Gyors vizsgálati módszerek

Automatizálás elve Automatizálás: Analitikai automatizálás: Az automatizálás olyan tevékenység, ahol az ember irányító szerepét berendezések veszik át Az automatizált rendszerben a műveletek, folyamatok irányítását, paraméterek beállítását erre kialakított gépek, berendezések, számítógépek végzik Analitikai automatizálás: Laboratóriumi műveleti egységek automatizálása Műveletek egymás utáni sorozatának automatizálása

Automata analizátor 70-es évek vége óta számítógép vezérlésű rendszerek PC vagy mikroprocesszorok (célkomputer)

Automata analizátor Fajtái: Diszkrét mintabevitelű analizátorok Folyamatosan áramló rendszerű analizátorok Analitikai robotok

Diszkrét mintabevitelű analizátor Analizálandó minták külön mintatartókban Reagensek előre elkészített kis tartályokban A mintákat külön-külön méri be az automatikus berendezés, majd a reagenst is Minta továbbítása a detektorhoz Mintánként több komponens is mérhető Kisebb teljesítő képesség (minta/óra), viszont általában nagyobb pontosságú

Diszkrét mintabevitelű analizátor Minta tárolók elhelyezésének módjai a, lánc b, zárt kör

Diszkrét mintabevitelű analizátor – centrifugális analizátor Egyedi minták gyors analízise Az oldatok áramlását a centrifugális erő biztosítja Egy keréken kb. 15-30 minta Mindegyik mintához külön reagens és detektor cella tartozik Mérés sebessége meg is haladhatja az áramló rendszerű analizátorok sebességét Mintacellák megtöltése analitikai robot segítségével automatizálható

Folyamatosan áramló oldószeres analizátorok Minták egyenkénti adagolása a vivő folyadékba Egyes mintákat levegő buborék, mosófolyadék választja el egymástól Rugalmas cső vezetékek, perisztaltikus pumpa Több csatornás analizátor használata esetén több komponens is mérhető egyszerre 100 minta/óra

Analitikai robotok Emberi tevékenységek utánzása, kiváltása: emelés, szállítás, adagolás, öntés…stb. Számítógép vezérelt A végrehajtott műveletekben nincs emberi hiba Mozgatása elektromos szervomotorral, léptető motorral, hidraulikus-, pneumatikus rendszerekkel Programozásuk nehéz, legelterjedtebb: tanító program

Analitikai robotok - példák Hamilton Decapper videó

Automata analizátorok - példák BioMérieux SA készülékek élelmiszer analitikai és klinikai laboratóriumok számára: TEMPO®: Az első automatizált mikrobiológiai teszt az élelmiszer iparban 500 mérés/nap Előkészítő rész, adatfeldolgozó rész (preparation station, reading station)

Automata analizátorok - példák

Automata analizátorok - példák TEMPO® Preparation Station TEMPO® Reading Station videó

Mintaelőkészítés automatizálása Analitikai robotok alkalmazásával Példa: Maxwell 16 készülék Felépítés:

Mintaelőkészítés automatizálása Felépítés: Mozgó fémállványzaton 16 mágnesrúd Mágnesrudak végére egyszer használható, műanyag őrlőrudak helyezhetők videó Működés elve: Paramágneses partikulumok (PMP) Szilikonnal bevont felszín, DNS kötődése

Mintaelőkészítés automatizálása Nem számítógéppel irányított, kész programokat tartalmaz Nem igényel különösebb szakmai előképzettséget Különböző tisztítási folyamatokra optimalizált készülékek: MaxwellTM 16 Blood DNA Purification Kit: humán és állati vér MaxwellTM 16 Tissue DNA Purification Kit: teljes szövet minták MaxwellTM 16 Cell DNA Purification Kit: prokarióta, eukarióta sejtek (Gram+-nál lizozimes előkészítés is kell!) MaxwellTM 16 Total RNA Purification Kit: RNS MaxwellTM 16 DNA IQ Reference & Casework Sample Kit: DNA IQ technológián alapul MaxwellTM 16  Polyhistidine Protein Purification Kit: Polihisztidin és HQ (His-Glu x 3) fehérje tisztítása baktérium-, emlős- és rovarsejttenyészetből

Automata analizátor Számos műszeres analitikai módszer automatizálható Fejlesztését és elterjedését az analitikai módszerek teljesítményeivel kapcsolatos egyre nagyobb igény hajtotta Az emberi munka helyettesítése, segítése, kiegészítése, finomítása Automatizálható: Mintavétel Mintaadagolás Elválasztási műveletek Reagens bemérés Oldatok homogenizálása Mérés analitikai műszerrel Mérési adatok összegyűjtése, tárolása, kiértékelése, szemléltetése

Automata analizátor Előnyök: Hátrányok: Bonyolult, komplex mérések kivitelezéséhez kisebb analitikus előképzettség is elegendő. munkaerő költség csökkentés Minden mindig a beállított paraméterek, utasítások szerint hajtódik végre. Optimálisabb reagens fogyasztás Általában azonos vagy nagyobb precizitású eredmények Nincs fáradtságból, figyelmetlenségből, linkségből adódó emberi hiba Általában rövidebb időt igényelnek, mint a manuális mérések Napi 24 órában is működtethető automata berendezések Hátrányok: Drága berendezések (hosszabb távon megtérül a költsége) Speciális berendezések, sok mérési módszerre, metódusra külön berendezés szükséges

Áramló oldatos technikák

Pl. LC, FIA, SIA, áramlási citometria Az áramló oldatos technikák magukba foglalnak minden olyan technikát, amiben az analit mérése folyamatosan mozgó folyadékáramban történik. Pl. LC, FIA, SIA, áramlási citometria A detektálást lehetővé tevő reakció/elválasztás az áramló folyadékban történik meg, és a minta detektorhoz történő szállításáról is a folyadékáram gondoskodik. http://books.google.hu/books?id=XHawkE9ZbFEC&pg=PA1&dq=flow+analysis&ei=UD74SvbfIYSWzASaxoTrDA#v=onepage&q=&f=false

1. Mágnesesen kevert keverési kamra Csőben áramló oldatba injektálják a mintát, majd egy mágneses keverővel ellátott cellában keverik össze a reagenssel, aztán újra csövön keresztül vezetik a detektorba. 2. Szegmentált áramlásos analizátorok A minta és a reagens keveredését itt már nem keverő végzi, hanem az áramlási csőben létrejövő turbulens áralmás. Az egyes mintákat buborékok választják el egymástól a csőben. http://www.cem.msu.edu/~cem333/Week13.pdf

Buborékok szerepe: korlátozzák a minta diszperzióját turbulens áramlást létrehozva elősegítik a minta és a reagens keveredését Ugyanakkor: buborék bevezetés/eltávolítás szükséges megnövelik a beüzemelési/leállítási (startup/settle) időt A módszer hátrányai: Viszonylag nagy reagensfogyasztás Nagy mintatérfogat igény

3. Áramló injektálásos analizátorok Ha az áramlási sebesség/csőátmérő elég kicsi, nincs szükség buborékokra. A FIA az a technika, amely folyadék mintát injektál mozgó, megfelelő összetételű, nem-szegmentált folyamatosan áramló vivőfolyadékáramba. A mintazóna koncentrációprofilja injektáláskor négyszögletes, majd a csőben haladva változik: lamináris áramlási profilt vesz fel a súrlódás miatt (a cső falával) radiális diffúzió (un. másodlagos áramlás)- ez segít minimalizálni a minták közötti keresztszennyeződés mértékét (a fal felé és onnan befelé irányuló áramlások következtében) longitudinális diffúzió (az előzőnél sokkal kisebb mértékű)

A diszperzió mértékét jellemzi: D=c0/c Ahol: c0 = a beinjektált minta koncentrációja c = a detektornál mért koncentráció (Kalibrációkor ezt a D-t megállapítják.) A diszperziót befolyásolja: mintatérfogat nagy térfogat, kisebb hígulás, kis térfogat, hígul az analit, D>1,0 csőhossz rövid csövek, kevés idő van a diffúziórakisebb mértékű diszperzió hosszú csövek, sok idő a diffúzióranagy mértékű diszperzió áramlási sebesség csőátmérő esetleg a tekercsátmérő

A diszperzió mértéke alapján csoportosítható: 1. Limitált diszperzió (D=1-3) rövid rekaciócsőhossz kis csőátmérő közepes-gyors áramlási sebesség nagy mintatérfogat detektorok: atomabszorpciós, emissziós spektrométer, ICP, elektródok 2. Közepes Diszperzió (D=3-10) lassabban végbemenő reakciókhoz alkalmas hosszabb reakciócső kisebb áramlási sebesség kis mintamennyiség Detektorok: szín, fluoreszcencia 3. Nagy mértékű diszperzió a sok időt igénylő reakciókhoz alkalmas hosszú reakciócső alacsony áramlási sebességlassú kis mintamennyiség, nagy mértékű diszperziókevésbé érzékeny (nem sokat használt, ilyen pl. az áramló oldatos titrálás) ANALITICAL CHEMISTRY, VOL. 53, NO.1, JANUARY 1981

Az áramló oldatos berendezések részei általában: automata mintaadagoló injekciós szelep : nagyon pontos térfogatbemérés, gyors injektálás a csőben lévő áramlás megzavarása nélkül többcsatornás perisztaltikus pumpa: (a pumpa sebessége és a csőátmérő határozzák meg az áramlási sebességet) nagyon fontos az állandó áramlási sebesség biztosítása, hogy az egyes minták tartózkodási ideje megegyező legyen (mivel a reakciók általában nem mennek végbe teljesen) feltekercselt reaktor: kis csőátmérő (0,1-1 mm), csőhossz <50 cm detektor (pl. spektrofotométer, elektrokémiai detektor, atomspektroszkópiás (AES, AAS)) termosztát gáztalanító szűrő

drága reagensek felhasználásának csökkentése: merging zones Egyéb FIA technikák drága reagensek felhasználásának csökkentése: merging zones inkubációs idő növelése a diszperzió növelése nélkül: stopped-flow (pl. enzimes reakciók) Szekvenciális injektálás (SIA): Az áramlás iránya változtatható Mikrogyöngy injektálásos technika (BI): az áramlási csőszakaszba reagenst tartalmazó gyöngyöket injektálnak, ezekben ill. ezek felületén játszódik le a reakció vagy a megkötés (zavaró mátrix komponensektől tisztítás). Alkalmas nagy érzékenységű immunanalitikai mérések elvégzésére is. http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6V5H-3WFXM57-6&_user=303407&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1084299857&_rerunOrigin=google&_acct=C000016619&_version=1&_urlVersion=0&_userid=303407&md5=bcde8f422eeb6cd31317618ad5ee0b32 http://adattar.atestor.hu:81/avl/cikkek/03_3_82-95.pdf

Az áramló oldatos technikák nagy előnye, hogy sok esetben megoldható velük a mintaelőkészítés is, fontosabbak: dialízis (folyadék és gáz) ioncsere oxidáció extrakció desztilláció

Alkalmazások Toxinok Makrokomponensek (fehérje, keményítő, cukor, …) Mikrokomponensek (vitaminok, elemek, zsírsavak…) Peszticidek

Áramlási citometria

Az áramlási citométer részei: áramlási rendszer lézer optikai rendszer Olyan analitikai módszer, mellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék egyedi tulajdonságait, pl. fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit tudjuk mérni. Az áramlási citométer részei: áramlási rendszer lézer optikai rendszer detektor számítógép

Hidrodinamikai fókuszálás: Célja:egyszerre csak egy részecske haladjon keresztül a lézeren

forward scatter: az áramlás irányára merőlegesen mérik a szórt fényt, a sejt mértére következtethetünk belőle side scatter: az áramlás irányával párhuzamosan méri a fényt, a sejt komplexitására jellemző fluoreszcencia: a vizsgálandó sejt valamely felszíni vagy intracitoplazmatikus markeréhez/markereihez olyan monoklonális ellenanyago(ka)t kötnek, mely fluoreszcens festékkel van kapcsolva. Általában valamely specifikus sejtfelszíni markerre terveznek antitestet, ezt jelölik festékkel (20-30 féle festék van forgalomban) http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html

Csak az élő sejtek fluoreszcens jelölése is megoldható Előnyei: Nagyon gyors mérést tesz lehetővé, nagy a mintaáteresztő képessége (23-48 minta egyszerre és 23 mérés óránként) Csak az élő sejtek fluoreszcens jelölése is megoldható Mivel különálló sejtek vizsgálatát teszi teszi lehetővé, nincs szükség kalibrálásra Általában nincs szükség inkubációs időre/szelektív dúsításra, ha szükséges, akkor is napokat spórolunk Nagyon érzékeny: Jelenlét/hiány: 1 db/g vagy ml Linearitás: 105 db/g vagy ml alatt http://www.rapidmicrobiology.com/news/8h9.php

Alkalmazásai: Patogének kimutatása üdítőkben, tejtermékekben, fermentált tejtermékekben, nyers és feldogozott húsokban. Élő sejtszám meghatározása (pl. sörkészítésnél)

Gyorsmódszerek

Miért van szükség a gyors módszerekre? Takarmány és élelmiszerbiztonság Gazdasági érdek Termékhamisítások megfékezése Bio-terrorizmus elleni védekezés Legfőbb előnyei: Gyorsabbak (JIT, rövid az analízis ideje) Olcsóbbak (olcsóbb munkaerő és analízis, kisebb logisztikai költségek) Egyszerűbbek Mobilisak Rapid methods for bioligical and chemical contaminants in food and feed, Wageningen Academic Publishers, 2005, p. 19-29

Gyors vagy alternatív módszerek további előnyei élelmiszerbiztonsági mérések hatékonyságának növelése Megfelelés a követelményeknek Nincs szükség bonyolult berendezésekre és képzett szakemberekre Real-time gyári folyamatok ellenőrzése A gyors módszereknek kiemelt szerepe van a HACCP-ben kritikus pontok in line ellenőrzésére szolgál (in line: gyorsan detektálják az eltéréseket, azonnal helyesbítik állandó termékminőségfogyasztói megelégedettség) Beérkező szállítmány, gyártásközi termék ellenőrzésnél: Pl. tej antibiotikum tartalmának mérésére 5-15 perc Húsok, halak antibiotikum tartalmának mérésére pár óra Kis mintamennyiséget igényelnek Világszerte hozzáférhető Folyamatellenőrzésben jól használható Az ideális gyorsmódszer: real-time kimutatást és mennyiségi meghatározást tesz lehetővé, akadályai:nagyon változatos komplex mátrixok kölcsönhatás

Mikrobiológia tesztek Immunanalitkai módszerek DNS Impedancia Áramlási citometria ATP mérés Közvetlen epifluoreszcens mérési módszer Gázösszetétel változás mikrobák azonosítására és mennyiségi meghatározására (patogének és indikátor organizmusok az élelmiszerekben és azok környezetében) Klasszikus mikrobiológiai módszerek: agaron növekszikidőigényes, fáradságos, élőcsíraszám meghatározáson alapszanak

ATP-mérés Mérési lépések: Átlátszó plate megtöltése a sejteket tartalmazó tápközeggel Kontrol készítés sejtek nélkül Reagens hozzáadása az oldatokhoz az oldat rázatása 5 percig Lumieszcencia mérés Előnyei: Kevesebb lépés A reagensek összemérése és keverése után kevesebb mint 5 perc alatt megvan az eredmény Stabil lumineszcens jel (30 perces felezési idő) Érzékenység: kevesebb mint 10 sejtből tud ATP-t mérni http://www.promega.com/tbs/tb337/tb337.pdf

Impedancia mérés A mérés elve: A sejteket olyan tápközegbe rakják, mely elektronikusan semleges vagy kissé ionizált. A tápközeg összetevőit a mikroorganizmusok nagy mobilitású vagy elektromosan töltött molekulákká alakítják. Ezt az átalakítást mérik a tápközegbe merülő két elektróda között Testing Capabilities A wide variety of tests on a wide range of microorganisms: Total microbial counts Coliforms Yeast and mold Lactic acid bacteria Challenge tests Shelf-life testing Microbial detection and enumeration Environmental monitoring http://216.62.91.163/industry/cosmetic/bactometer/index.htm

A gyorsmódszerek két csoportja Fenotipizálás: Biokémiai Konduktometriás ATP biolumineszencia mérés Immunassay Bakteriofág assay Genotipizálás: Nukleinsav hibridizáció DNS amplifikáció Megbecsülik egy speciális génszekvencia jelenlétét A kifejezett tulajdonságoktól függnek Részben vagy teljesen automatizálhatók, szimultán több multiplex minta analízisét teszik lehetővé és gyorsabbak, mint a klasszikus módszerek.

Kémiai szennyezők kimutatása Kémiai veszélyek fellépések lehetőségei: Peszticidek (ELISA, lateral flow) Mezőgazdaságban használt vegyszerek (ELISA, lateral flow) Mikotoxinok (ELISA, immunaffinitás oszlop, immunkromatográfiás teszt) Állatgyógyászati szermaradványok (tejben, húsban, tojásban, …) (ELISA, lateral-flow) Feldolgozás során az élelmiszerbe kerülő szennyezők Szennyezők a csomagolószerekből Sütés közben keletkező karcinogén vegyületek Keresztszennyezők Hamisítások miatt élelmiszerbe kerülő anyagok Nehézfémek (arzén, higany: bioszenzorok)

Immunanalitikai módszerek

Immunanalitikai módszerek Módszer elve: A célvegyületet (antigént) az ellene termelt és hozzá specifikusan kötődő antitest segítségével tesszük kimutathatóvá. Alkalmazott módszerek: ELISA Lateral-flow Bioszenzorok

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Elv: Enzimjelölt Antigén-Antitest komplexet alakítanak ki szilárd fázison, amelyhez adagolt enzim-szubsztrátból detektálható termék képződik. Négy tipus: Direkt Indirekt Kompetitív Nem kompetitív (szendvics)

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Direct ELISA Indirect ELISA

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Sandwich ELISA Competitive ELISA

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Alkalmazás a gyakorlatban: Mikotoxinok Hormonok és anabolitok Peszticidek Antibiotikumok Toxinok Patogén mikróbák Hamisításból eredő kontamináció

Bioszenzorok Szenzor: speciális műszeres érzékelők amelyek egy adott komponens mérésére vannak kialakítva, 3 főrész: Molekulafelismerő Jelátalakító Jelfeldolgozó Bioszenzor működési elve: Immobilizált enzimek a szubsztrátot termékké alakítják át, amit a szenzorok érzékelnek.

Bioszenzorok – működési elv

Bioszenzorok 2 rész: Elektronikus egység Immunoszenzor 4 db egyszer használatos eldobható membrán

Bioszenzorok - alkalmazás E. Coli detektálása (vízminőség ellenőrzése) DNS alapú, platina elektródon polipirrollal elektropolimerizált bioszenzorral. Polipirrol Elektropolimerizáció a munkaelektród felületén DNS jelenlétében 25 bp DNS-szakaszt felismerő polimerfilm képződése, amely specifikus az uidA génre, az E. Coli K-12-es törzsére.

Bioszenzorok – Felületi plazmon rezonancia Módszer elve Felületi plazmon: elektronsűrűség hullám két anyag határán Ha a beeső fény polarizációs síkja párhuzamos a beesési síkkal, valamint a felülettel párhuzamos impulzus komponense megegyezik a felületi plazmon impulzusával, akkor a fény gerjeszti a felületi plazmont Visszavert fény intenzitása csökken

Bioszenzorok – Felületi plazmon rezonancia Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRI): a fém felület biopolimerekkel borított 2 fő felhasználás: Dielektrikumként víz, módosított fémfelület, specifikus kötőhelyek sokféle kölcsönhatás alapján (At-Ag, DNS hibridizáció, protein-protein…stb.) Intenzitásváltozás az idő függvényében Nyomanalitika:Szelektív reakció

Bioszenzorok - Felületi plazmon rezonancia Alkalmazás: ricin fehérje ricinus communis növényből Sejtmembránon található cukor alapú ricin receptorhoz hasonló cukorszármazékot használnak

Bioszenzorok - Felületi plazmon rezonancia

Microarray

Microarray (v. chip): kisméretű üveg- v Microarray (v. chip): kisméretű üveg- v. műanyag lap, melyre négyzetrács szerinti elrendezésben biológiai póbákat visznek föl, minden pontba mást. A vizsgált biológiai anyagot ezzel hozzák kölcsönhatásba, és valamilyen módon detektálják, mely pontokban jött létre kölcsönhatás. Típusai: DNS microarray (oligonukleotid vagy cDNS) Peptid v. fehérje microarray

DNS microarray A próbák lehetnek: Oligonukleotidok (20-25 nukleotid) DNS-fragmentumok (kb. 500-5000 nukleotid) Az analízis lépései: Megtisztítják a DNS-t vagy RNS-t Reverz transzkripcióval (cDNS) vagy PCR amplifikációval jelölt termékket állítanak elő (általában fluoreszcensen jelölt) A jelölt mintát hibridizációs pufferrel keverik A mintát a microarray felszínére juttatják és keverik A nem specifikus kötéseket lemossák Megszárítják Lézerrel gerjesztik és mérik az emissziót Feldolgozzák az adatokat

Alkalmazása: Mikotoxinok: a mikotoxinok bioszintéziséért felelős géneket azonosítják Patogének: a baktériumok genetikai markereire tervezik a próbákat (Salmonella, Shigella, E. coli, Yersinia, Staphylococcus, Listeria, Clostridium, Campylobacter, ….) Vírusok Genetikailag módosított élelmiszerek kimutatása/vizsgálata

Egy további hibridizáción alapuló módszer Lízisreagens hozzáadása a nukleinsavak kinyersére A lizált mintát ELISA plate szerű lemezre viszik Hozzáadják a reagenst: poli dAvéggel rendelkező a target rRNS 5’ végével komplemente oligonukleotid target rRNS 3’ végével komplemente oligonukleotid az 5’ végén torma perixidáz enzimmel jelölve Mosás Enzimszubsztrát hozzáadása inkubálás Spektrofotometriás detektálás Salmonella, Listeria spp., Listeria monocytogenes, és Campylobacter (1-5 CFU/25g) kimutatására alkalmas, kevesebb mint 2 órán belül ad eredményt, http://www.neogen.com/FoodSafety/GQ_Index.html

A fehérjechipek A cDNS microarray módszer analógiájára jöttek létre. Kezdetben ELISA-tálca vályúiba rögzítettek megfelelő antitesteket. Ezt PBDF membrán váltotta fel, ennek pontjaira csöppentették és rögzítették az ellenanyagot. Alkalmazása: Allergének Peszticidek

PCR Alkalmazások: Patogének kimutatása (mennyiségi meghatározás) Mikotoxintermelő gombák kimutatása GMO kimutatása (genetikailag módosított részarány) Szennyezések, allergének kimutatása Élelmiszer eredetvizsgálat, hamisítások felderítése

Egyéb gyorsvizsgálati technikák: Roncsolásmentes technikák: NIR NMR Műszeres érzékszervi vizsgálatok (pl. színmérés, elektronikus orr)