Kromatográfia Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., Budapest, 1997. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia, BME jegyzet, Budapest, 2003. Gáspár Attila: Kapilláris zónaelektroforézis, DTE, Debrecen, 2000. G. Subramanian, Chiral Separation Techniques, Wiley, 2007. R.P.W. Scott, Principle and Practice of Chromatography, http://www.chromatography-online.org/Principles/Applications/rs69.html

Kromatográfiás folyamat Kromatográfia elválasztási módszer. Kromatográfiában az állófázis és a mozgófázis között megoszlanak az anyagok megoszlanak egyensúlyi állandójuk szerint. A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a beinjektálási ponttól a detektorig jut. Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később eluálódnak mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.

Egy csúcs megoszlása az állófázis és mozgófázis között Az állófázisban lévő anyag lemarad a mozgófázisban lévőtől az anyagátadási ellenállás miatt

A csúcsok szélesedése a diffúzió miatt Az anyag kromatográfia során egyre szélesebb tartományt foglal el a diffúzió és az egyenlőtlen V alakú áramlás miatt.

Csúcsszélesedés az egyenlőtlen áramlás miatt

Csúcsok szélesedése az egyenlőtlen áramlás és az anyagátadási ellenállás miatt Egyenlőtlen áramlás csatornába, zegzugosság IIdő míg a közepéről a falhoz, anyagátadási ellenálás a mozgó fázisban Üregek rosszul öblitettek csak diffuzióval kerülnek elő R. L. Snyder, J.J. Kirkland, Introduction into Modern Liquid Chromatography, Wiley, 1979

Kromatográfiás elválasztás modellezése

Elválasztás kisebb oszlopátmérővel vagy hosszabb oszloppal lehet javítani GC Chirasil-Dex 10 m SFC

Kromatográfiás csúcs

Csúcsalak formái

Kromatográfiás kifejezések Elméleti tányérszám N = 5,54 (tR/wh)2 Kapacitás arány k = tR’/t0 A csúcs Gauss görbe alakú

Az elérhető hatékonyság nem függ a mozgófázistól. M.L. Lee, Ph.D course A diffúzió és az anyagátadási ellenállás ellentétes hatással van a hatékonyságra, ezért a hatékonyságnak optimuma van az áramlás függvényében.

Kromatográfiás kifejezések Szelektívitás = tR2’/ tR1’ Felbontás Rs = 1,177 (tR1-tR2)/Wh1+Wh2) Rs : 1,5 alapvonal felbontás

Felbontás csúcsarány összefüggés eltérő nagyságú csúcsoknál Nagyságrendekkel eltérő mennyiségű csúcsok pontos Kiértékeléséhez Rs >1,5 érték szükséges.

Nem kellően elvált csúcsok területének meghatározása bizonytalan V.R. Meyer, Chromatographia 40 (1995) 15.

Aszimmetrikus csúcsok területének meghatározása bizonytalan

A hegyesebb csúcsok jobb elválasztást adnak

Felbontás függése k, n és  értékétől A mindennapi gyakorlatban fontos szerepet játszik felbontás növelése mellett az analízis idő csökkentése és a túlterhelés elkerülése is. P. Sandra, HRC 12 (1989) 82. Az ideális kromatográfiás paraméterek kompromisszumok eredménye.

Túlterhelés hatása

Kis mintamennyiség is túlterhelheti a kromatográfiás rendszert Oszlop: 10 m x 0.1 mm CSP: Chirasil-Dex Vivő gáz: H2 Hőmérséklet: 170C Származék: ciklikus dikarbonát GC Extrém eset, általában 1-2 nagyságrenddel jobb.

Túlterhelés problémái

Kromatográfia felosztása

Kromatográfia felosztása oszlop szerint Töltetes oszlop kromatográfia Kapilláris oszlop kromatográfia Chip kromatográfia Vékonyréteg kromatográfia (TLC) Kromatográfia felosztása kölcsönhatások szerint Megoszlásos kromatográfia Adszorpciós kromatográfia Kizárásos, gél (exclusion) kromatográfia Ioncserés kromatográfia

Kölcsönhatások típusok megoszlásos kromatográfiában A HPLC és CE-ben az ionos kölcsönhatásoknak nagy a szerepe. Királis kromatográfiában a taszító kölcsönhatások fontos tényezők.

Chipek, mint kromatográfiás oszlopok EKC Mars szondán használt kromatográf

Kapillárisok a királis kromatográfiában Kapilláris: GC, SFC, CE, CEC Töltött: SFC, HPLC

Töltetes és kapilláris oszlopok összehasonlítása GC-ben A kapillárisok kisebb áramlási ellenállása miatt sokkal hosszabb oszlopokat használatát teszi lehetővé, ami nagyobb hatékonyságot és ezért jobb felbontást biztosít.

Különböző kölcsönhatási erők szerepe egyes kromatográfiás módokban Ideális kromatográfiás Módok egyes anyagokra GC Könnyenilló, hőstabil vegyületek HPLC Poláros, nehezen illó, hőre bomló vegyületek EKC Ionos vegyületek

Királis kromatográfia felosztása I Közvetlen módszer (direkt ) A szelektorok és a vizsgálandó anyagok kromatografálás közben alkotnak ideglenes diasztereomer asszociátumokat. A közvetlen módszernél a diasztereomer asszociátumok stabilitási különbsége eredményezi az elválasztást. Közvetett módszer (indirekt) A diasztereomer asszociátumokat kromatografálás előtt szintetizáljuk, és ezeket akirális állófázison analízáljuk

Királis kromatográfia felosztása II. Oszlop szerint: töltetes, kapilláris (üres cső), TLC és chip Mozgófázis szerint: GC, SFC, LC, EKC és CEC EKC és CEC a kapilláris elektroforézis (CE) és a kromatográfia kombinációja Szelektor helye szerint: királszelektív állófázis (CSP), királszelektív mozgófázis adalék (CMA)

A királis állófázis (chiral stationer phase, CSP) működési elve C. Welch et al., Review of Stereochemistry

A királis mozgófázis adalék (chiral mobile phase addtitive, CMA) működési elve) C. Welch et al., Review of Stereochemistry

Kromatográfia előnyei a királis analízisben Magas ee. (> 99.9%) esetén is pontos eredmény Nincs szükség optikailag tiszta standardokra Kis mintaszükséglet Egy analízis alatt több enantiomer pár is meghatározható Gyors módszer Mátrix komponensek zavarása kiszűrhető Széles lineáris tartományú módszer On-line kapcsolás a szerkezetazonosító módszerekhez Fejlett műszerezettség, automatizáltság Az enantiomer párok tagjainak jelét egymástól függetlenül értékelii a rendszer. Az első két pont. A jelek egymástól függetlenül, azonos reszponzal jelentkeznek. Single cell analysis A szétválsztott anyagok egymástól függetlenül.laktonok, NMR A erc töredéke alatt Megfelelő kromtográfiás paraméter, több dimennzió, MS kapcsolat Detektorok fázisok kapacitása. ON-line MS, IR, NMR, CD Precizitás, éjszakai működés

Kromatográfia előnye a királis elválasztásban GC GC Példák Mátrixhatás kiküszöbölhető, Gyors módszer nyomnyi mennyiségek meghatározhatóak

Egy analízis alatt számos komponenst lehet meghatározni GC Az egy analízis alatt többre is példa, flexibilis szelektor sok molekula, ChiraSIL-dex ALAFA, BÉTA, GAMMA, CHIRASIL-Val csak szubsztituálatlan alfa

A különböző kromatográfiás módok előnyei a királis analízisben Tulajdonság GC SFC HPLC EKC Hatékonyság ++++ +++ ++ Analízis hőmérséklet + Mozgó fázis hangolása / Analízis sebessége Érzékenység Kidolgozottság

Különböző kölcsönhatások szerepe az egyes királis kromatográfiás módokban Típus GC SFC HPLC EKC Diszperziós ++++ +++ ++ +  -  Dipól - dipól Hidrogén-híd Ionos / Taszító A királis felismerő kölcsönhatásoknak legjobban megfelelő módot érdemes kiválasztani. GC a funkciós csoport nélküli szénhidrogén enatiomerek elválasztására is alkalmas.

A királis kromatográfia általános szabályai Merev szerkezet nagy szelektivitást tesz lehetővé. Flexibilis szerkezet széles felismerési spektrummal rendelkezik. A z elválasztások túlnyomó része a hárompontos kölcsönhatásokra vezethető vissza. Királis centrumhoz közeli funkciós csoportok segítik az elválasztást. A taszító kölcsönhatásoknak nagy szerepe van. A szelektivitásoknak az alacsony analízis hőmérséklet kedvez.

A királis elválasztás energiaigénye és hőmérséklet függése ln α = S+- (S0sm)/R - H+- (H0sm)/RT  +- : különbség a két izomer (+ és -) között sm: különbség a két fázis (álló és mozgó) között Az esetek 99%-ában kromatografálás hőmérséklet csökkentése exponenciálisan javítja az elválasztást. A hőmérséklet csökkentésesének az analízis ideje, hatékonyság, és a minták kromatografálhatósága szab határt. Az Rs 1,5 eléréséhez 0,1kJ/mol kölcsönhatás energiakülönbség (α: 1,01) is elég lehet. Entalpia tartomány ha chöm csökkentésével nő az alfa. Ha a görbe eltér a lineáristól több felismerő mechanizmus. Alacsonyhőmérsékleten megfagyhat a mozgófázis, vagy az álló, romlik a hatásfok. Nincs elég tenzió.

Enantiomereknek fordított az elúciós sorren-dje az entalpia és az entrópia tartományban

A flexibilis szelektrorok szelektívitása mérsékelt Flexibilis szelektorok (pl. CDk) mérsékelt szelektivitását nagy hatékonysággal lehet kompenzálni. Ezeket főleg kapilláris oszlopoknál alkalmazzák. Akár  = 1,01 is alapvonal elválást eredményez. GC Az egy analízis alatt többre is példa, flexibilis szelektor sok molekula, ChiraSIL-dex ALAFA, BÉTA, GAMMA, CHIRASIL-Val csak szubsztituálatlan alfa

A merev imprinted állófázis nagy szelektívitást biztosít néhány enantiomer pár felé CEC Adott enantiomer, bifunkciós reagensek, polimerizálás, kioldás. Adott termékre érdemes kifejleszteni. O. Brügemann Molecular Imprinted Mat. Adv. In Biochem Eng. 76 (2002) 127. Imprinted állófázisok nagy anyagátadási ellenállással rendelkeznek ezért hatékonyságuk mérsékelt

Nyomnyi mennyiségek meghatározása nagy csúcs mellett, több nagyságrendet átfogva Kis csúcs elsőként elúciója ajánlott, hogy a nagy csúcs farka (tailingje) ne fedje el.

Fordított elúció CSP váltással

Kis csúcs előbb pontosabb eredményt ad

Reakció Dani reagenssel A reagens kiralitása meghatározza az elúciós Sorrendet. Péter A., D.Sc. tézisek 2004

Királis kromatográfiában leggyakrabban használt oszlopok jellemzői Tulajdonság Oszloptípus Kapilláris Töltetes Előny Nagy hatékonyság Terhelhetőség Oszlop hossz EKC: 0,05 –0,5 m GC: 10- 100 m 0,05 – 0,5 m Rs> 1,5- höz szükséges  1,01-1,03 1,1-1,3 Alkalmazott CSPk és CMAk Kevésbé szelektív, gyors (ciklodextrinek) Nagy szelektivitású (cellulózok) Kromatográfiás mód GC, SFC, EKC HPLC, SFC, CEC

Királis elválasztások javításának lehetőségei a kromatográfiában Hatékonyság javítása (oszlopméret, optimalizált fázisok) Szelektivitás javítása (akacsony analízis hőmérséklet, optimalizált fázisok, akirális származékképzés) Csúcsok elúciós sorrendjének megválasztása Megfelelő kromatográfiás mód kiválasztása összhangban a szelektorral és mintával

Enantiomerarány meghatározását zavaró hatások a kromatográfiában

Kromatográfia hátrányai a királis analízisben Mérsékelt terhelhetőség Szakaszos üzemmód Korlátozott szerkezeti információk Az állófázisok nem csak királis szelektorokból állnak. A két fázis közül valamelyik könnyen túltelíthető, nem lineáris Langmuir.