ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VI. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK GÉLKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

GÉLKROMATOGRÁFIA SEC GPC GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY SEC GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY GPC

Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath (1961-63) Size Exclusion Chromatography (SEC) Méret szerinti kizáródásos kromatográfia Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula „szitálás” matematikai modellje Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC) Casassa (1967), Ogston (1968-70) Termodinamikai értelmezés Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA

A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE

Térhálós szerkezetű polidextrán alapú xerogél (Sephadex) pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

PORÓZUS SZILIKA GÉL ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE

GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) Kémiai tulajdonságai: Szerkezet – stabilitás Funkcionális csoportok Biológiai aktivitás Molekula méret-tömeg, eloszlás Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek Fizikai tulajdonságai: Oldékonyság (poláris-apoláris) Szolvatáció – hidratáció Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció Hidrodinamikai jellemzők Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó, belső viszkozitás, flexibilitás

GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ) ADALÉKOK detergensek, stabilizálók, antioxidánsok, antibakteriális vegyületek, stb,

GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás, SZERVETLEN OXIDOK SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék (CPG), SZERVES POLIMEREK Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metakrilát, poliéter- észter, polivinilalkohol, polisztirol-divinilbenzol, KEVERT TÍPUSOK Szervetlen-szerves - Si02- poliszacharid, Szerves-szerves – dextrán - agaróz, Egyéb polimerek - akrilamid - PS-DVB

AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

POLÁRIS – HIDROFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK GFC - SEC POLÁRIS – HIDROFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK Elnevezés Összetétel Gyártó - Forgalmazó Sephacryl S 100 -1000 Allil - dextrán akrilamid Pharmacia-LKB Superdex 30-200 Dextrán-agaróz SynChrom GPC Polipropil-gliceril Waters- Millipore Sigmachrom GFC 100-300 Dextrán - polietilénglikol Sigma-Aldrich Chitopearl Chitopack Kitin – kitosan poliszacharid Fuji Spinning Co. (Japán) Nucleosil Phenomenex GPC-P Daisogel 2205 SiO2 Macherey-Nagel Phenomenex Daiso (Japán) Unisphere Al2O3 Biotage HA Type 8 Hidroxiapatit Koken Science

APOLÁRIS – HIDROFÓB/ORGANOFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK GPC – SEC APOLÁRIS – HIDROFÓB/ORGANOFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó Styragel HMW PS – DVB Waters Fractogel TSK Szilikagél, ill. Merck G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer Toyopearl HW 55F TosoHaas Metachem GPC 102 - 106 PS - DVB Metachem Tecnol. Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates BioSep SEC 2000-4000 Phenomenex Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co. PL gel MIXED Polietilénnel kevert PS-DVB Polymer PL Aquagel OH Polihidroxid Polihidroxil Lab Ltd, Shodex UT 800 KF 80 M Poliszachariddal kevert PS – DVB kopolimer Showa Denko

Kereskedelmi HPLC-SEC oszloptöltetek Nanorészecskék, makromolekulák, biopolimerek elválasztására Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó Sepharose CL 2B, 4B, 6B Dextrán-agaróz Pharmacia LKB Sephacryl S 200, S 300 Dextrán-akrilát Styragel HMW PS – DVB Waters Fractogel TSK Szilikagél, ill. polimer Merck TSKgel G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer TosoHaas Toyopearl HW 55F, -75 Etilénglikol/metakrilát kopolimer Shodex HA 30 Hidrofil PS - DVB Shodex UT 800 KF 80 M Poliszachariddal kevert PS – DVB Showa Denko PL aquagel OH Polihidroxid- polimer gyanta Polymer Laboratories PL gel MIXED Polietilénnel kevert PS-DVB Phenogel OH Hidrofil polimer gyanta NUCLEOGEL GFC Macherey-Nagel BioSep SEC 2000-4000 Phenomenex Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co. Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates Metachem GPC 102 - 106 PS - DVB Metachem Technology

Sephadex G gélek kromatográfiás tulajdonságai Géltípus Gélágy térfogata cm3/g xerogél* Kizáródási moltömeg (kDa) Frakcionálási tartomány (kDa) G-10 2 – 3 ≈ 0,7 0,7 alatt G-15 2,5 – 3 – 5 ≈ 1,0 1,0 alatt G-25 4 – 6 5 1 –5 G-50 9 – 11 30 1,5 – 30 G-75 12 – 15 70 3 – 70 G-100 15 – 20 150 4 – 150 G-150 20 – 30 400 5 – 400 G-200 30 – 40 800 5 - 800 A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően: durva (coarse) 100-300, közepes (medium) 50-150, finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) 10-40 lehet.

HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK (BioBeads, 5 m) SEM KÉPE

HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE

HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI

A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE

AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %) Agaróz 0.3 – 1.5 Sephadex 3 - 30 Poliakrilamid 2.5 - 15 A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) ! ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek. A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.

Az elválasztás technika szemlélete szerint a GÉLKROMATOGRÁFIA a FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA SPECIÁLIS HATÁRESETE ahol az álló és az áramló fázis ugyanaz az oldószer, a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák. Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA a fázisok közötti térfogati megoszlás (fázisarány, megoszlási együttható) a molekula méretének (tömegének) függvénye. Kav ~ f(log M) (A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)

(Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt Kav = 0 – 1 log M  Kav BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL log M  Ve / V0 = Kav (Vt – V0) (Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt Kav = 0 – 1 log M  Kav Determann egyenletek (1966-69) Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre Ve Vo logM = M0 - (6.06-5.00 )  = a xerogél szemcse sűrűsége

MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval

A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA BEKONCENTRÁLÁS SÓMENTESÍTÉS PUFFER CSERE CSOPORT FRAKCIONÁLÁS TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA KROMATOFOKUSZÁLÁS

MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM) CHYLOMICRON VLDL

A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA ELFO VLDL LDL HDL UC

HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN

SEC LDL HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA AGARÓZ (Sepharose 6B) GÉLOSZLOPON VLDL HDL

Fehérje és lipid micellák PLAZMA MEMBRÁN ÖSSZETEVŐK SZOLUBILIZÁLÁSA DETERGENSEKKEL (SDS - Na-dodecil szulfát) SDS (900 – 5 min) Detergens Sejtmembrán Fehérje és lipid micellák

- o - - X - - ● - Májsejtek plazma membrán fehérje és lipid tartalmának elválasztása detergens gélkromatográfiával Sepharose 4B oszlopon.