Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium kv1n1lv1 Bemutatkozás

Szükséges-e az egyensúly? SHS, SPME, SBSE Szükséges-e az egyensúly? A t

Mérendő komponens illékonyságának növelése Származékképzés Miért ? : Mérendő komponens illékonyságának növelése Mérendő komponens termikus stabilitásának növelése Retenciós tulajdonságok megváltoztatása Kimutatási határ csökkentése

Folyadék kromatográfia – HPLC

Varsói Természettudományi Társaság Biológiai Közleményei A kezdet 1903 Varsói Természettudományi Társaság Biológiai Közleményei

HPLC vs. GC

Mérendő komponens hőstabilitása Elpárologtatás miatt kell HPLC vs. GC Paraméter GC HPLC Mérendő komponens hőstabilitása Elpárologtatás miatt kell Az analízis általában szobahőmérséklet körül megy Mérendő komponens molekulatömege Jellemzően <700 Csak az oldhatóság jelent határt Mintaelőkészítés Végén illékony oldószer Szűrés kell, oldószer legyen az eluenssel elegyedő Áramlás Nyomás vezérelt Áramlási sebesség vezérelt Mozgófázis szerepe a szelektivitásban Nem jellemző Erősen befolyásol

A HPLC rendszer főbb részei

Mozgó fázis gázmentesítése He sparging, on-line vacuum degassing, refluxing, vacuum filtration, ultrasonication

Pretreatment with automatic injection system: Automata injektor Pretreatment with automatic injection system:

HPLC-s módszerek típusai Mérendő komponens Módszer Állófázis Mozgófázis Semleges, gyenge sav, gyenge bázis Fordított fázisú C18,C8,C4, ciano, amino Víz/szerves Módosítók Ionos, savas, bázikus Inpárképzés C18, C8 Víz/szerves ionpárképzők Vízoldhatatlan Normál fázisú Szilika, ammino, ciano, diol Szerves Szervetlen ionok ioncsere ioncserélő Vizes puffer Nagy molekulatömegű Méretkizárásos Szilika Gélszűrés – vizes Gélpermeáció-szerves

Preparativ oszlop 40-100 mm i.d. Oszlopgeometria Preparativ oszlop 40-100 mm i.d. Félpreparativ oszlop 20 mm i.d. Félpreparativ oszlop 8 mm i.d. Analitikai oszlopok 3,0; 4 vagy 4,6 mm i.d. Mikro(bore)oszlopok 1 vagy 2 mm i.d. Kapilláris oszlopok 20-800 mm i.d. acél vagy PEEK Gyors oszlopok 2,0- 4,6 mm i.d.

Nyomásesés a kolonnán: Van Deemter egyenlet Nyomásesés a kolonnán: Dp- nyomásesés; f- kolonna áramlási ellenállása; - eluens viszkozitás; L- kolonna hossz; dp- töltet átlagos szemcseméret dp= 10 mm H dp= 5 mm dp= 3mm u (cm/sec)

A folyadékkromatográfiás állófázisok - szervetlen FÉMOXIDOK: SiO2, Al2O3, CaO, MgO, BaO, TiO2, CeO2, ZrO2, SÓK: SZILIKÁTOK, Mg-Al szilikátok és egyéb összetett vegyületek (Florisil, földpátok, bentonit, kaolin, síkpor, agyag) KARBONÁTOK, SZULFÁTOK (Ca-Mg-karbonát, Ca-szulfát), FOSZFÁTOK (Ca-, Zr-, HIDROXI APATIT) NITRIDEK – BN PORÓZUS ÜVEG SZEMCSÉK (Controlled Pore Glass, CPG 75-3000 μm) CPG GLYCOPHASE (gliceropropilszilán réteggel) SZERVETLEN (SZILIKA) – SZERVES (POLIMEREK) KEVERT TÍPUSOK

A folyadékkromatográfiás állófázisok - szerves SZÉN (aktív C, porózus grafitált karbon, PGC) POLISZACCHARIDOK (cellulóz, keményítő, porcukor) DEXTRÁN (keresztkötésekkel térhálósított gélek, Sephadex) AGARÓZ (agar-agar, agaropektin) POLIAMID POLIAKRILAMID (akrilamid - metilén bis-akrilamid kopolimer) POLIETILÉN IMINEK

Szilika alapú állófázisok Silica Sols Xerogels Spherical Irregular Particles are 3-10 m in diameter for standard columns.

Ismétlés vége

Monolit oszlopok

Folyadékkromatográfiás állófázisokról ALAK-FORMA IRREGULÁRIS – TÖRMELÉK SZEMCSÉK (POROK) GÖMBSZIMMETRIKUS – SZFEROID SZEMCSÉK SZEMCSEMÉRET >1 m ELOSZLÁS - HATÁROK GAUSSI, vagy ASZIMMETRIKUS ELOSZLÁS, HOMODISZPERZ - HETERO(POLI)-DISZPERZ SZERKEZET HOMOGÉN (TÖMÖR) SZEMCSÉK ADHÉZIÓVAL, vagy KÉMIAILAG KÖTÖTT FELÜLETI RÉTEGEK PORÓZUS (PELLICULÁRIS) FELÜLETI RÉTEGEK TÁGPÓRUSÚ (PORÓZUS, PERFUZÍV) TÖLTETEK TÖMBPOLIMER (MONOLIT) OSZLOPOK … HALMAZ ÁLLAPOT SZILÁRD (rigid, xerogél) – GÉL (liogél) – FOLYADÉK STABILITÁS NYOMÁS, HŐ, pH, OLDÉKONYSÁG, BAKTERIÁLIS, KÉMIAI

Állófázisokkal szemben támasztott követelmények Stabilitás (nyomás, hő, pH, oldékonyság, bakteriális, kémiai…) Minél kisebb és homogénebb szemcseátmérő (hatékonyság és nyomásesés) Energetikai homogenitás (visszatartásért felelős helyek homogén eloszlása);

Állófázisok jellemzése Az átlagos pórus átmérő A fajlagos felület A fajlagos pórustérfogat Ideális eloszlás Pórus átmérő gyakoriság (%) Ne legyen pórusgátlás (Feltétele hogy a molekula mérete egy nagyságrenddel kisebb legyen mint pórusátmérő) Ideális eset Későn jön ki (tailing) Beszorul (tailing) dp átlag dp (nm)

A szilikagél szerkezete

OH Si O H OH Si O A szilikagél felülete Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8) Határfelületen nem disszociált szilanol csoportok OH Si O Szilárd fázis Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”) OH Si O Izolált szilanol csoportok Vicinális szilanol csoportok H Dezaktivált szilanol csoportok

Fémszennyezések hatása Legproblémásabb szennyezők: Fe(III), Al (III) Problémák: Kelát képzés Reaktív/savanyúbb szilanol csoportok

Fémszennyezések hatása

Módosított szilika állófázisok Si CH3 O CH2 NH2 Árnyékoló Távtartó Kölcsönható CN NO2 CH(OH)-CH2(OH) C18 …..

Módosított szilika állófázisok NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP) - OH (diol) - C2, -C4, -C8, -C18 - CN (ciano) - C6H5 (fenil) - NO2 (nitro) - etil, - NH2 (amino) - i-propil - N(CH3)2 (dimetil amino) - i-butil

Módosított szilika állófázisok

Módosított szilika állófázisok

Módosított szilika állófázisok Classic ODS Conventional (non-endcapped) Sterically Protected (non-endcapped) Conventional (endcapped) * Savasan hidrolizálhat

Normál fázisú folyadékkromatográfia

Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis Mikor alkalmazzuk? Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására; Hexán oldható vegyületek; Helyzeti izomerek elválasztására. Állófázisok Szilikagél (40-50%); Alumínium-oxid (3-10%); Királis állófázis (20-25%); Módosított szilikagél (pl. NH2, CN, NO2, diol stb.).

Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Komponens adszorpcióját befolyásoló tényező (minél nagyobb a kötödés, annál nagyobb a visszatartás): a vegyület leszorítja az oldószer molekulákat a szilárd fázis felületéről; Oldószer víztartalma (H-hidas kötésekkel megakadályozza a vegyületek megkötődését, víztelenítés vízmentes különböző polaritású oldószerekkel vagy N2-el szárítás 150C-on; Pórusok átmérője; Szilanol csoportok típusa; Fémszennyezők jelenléte (polarizálja a szilanol csoportot), a harmadik generációs szilikagélekre a fémtartalom < ppm).

Normál fázisú folyadékkromatográfia Aluminium-oxid (pH = 2 – 12 ) Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt (általában bázikus vegyületeknél); Gyengébb adszorpciós kölcsönhatást mutat; Olyan vegyületek vizsgálatára, amelyek savkatalízisre bomlanak; Alakszelektivitást szeretnénk elérni; Szilikagéltől eltérő szelektivitás. H általában Módosított szilikagél (pH = 2 – 8 ) Al2O3 Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt; Víz dezaktiváló hatás csökkentése; Szelektivitás növelése; A mozgófázis polaritásától függően lehetnek fordított fázisú töltetek!!! Mert jobb a pórusszerkezet u (cm/sec)

Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Mozgófázisok (eluens) Apolárisabb az állófázisnál Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel Detektor kompatibilitás Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O2 mentes stb.) Alacsony viszkozitású ( < 1 cP 25C-on) Könnyen beszerezhető, elfogadható áron Biztonságos (CCl4 benzol stb. egészségre káros) Könnyen keveredő Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt)

Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Oldhatóság, polaritás növelő oldószerek: Alap oldószerek: Hexán Heptán Izooktán Diklórmetán Diklóretán Kloroform (stabilizálás etanollal !!!) Modifikátorok: Módosító szerek az állófázis felületét megváltoztatják (csökkentik a retenciót); Fém szennyeződések maszkírozására ecetsavat Vizet és aminokat nem használunk – irreverzibilisen kötődnek

Fordított fázisú folyadékkromatográfia

Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP) RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer (elválasztások 80%-a); Állófázisok Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 28); Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 114); Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%)

Fordított fázisú folyadékkromatográfia Szerves polimer alapú állófázisok A teljes pH tartományban alkalmazhatóak; Térhálós szerkezetűknek tulajdoníthatóan nagy mechanikai stabilitással rendelkeznek; Mikropórusok képződése elkerülhetetlen, így kinetikai hatékonyságuk kisebb mint a szilikagél alapú állófázisoké. Sztirol Divinil-benzol Kopolimer

Fordított fázisú folyadékkromatográfia Szerves polimer alapú állófázisok A szerves polimert oldó oldószerek (klórozottak) duzzasztják a polimert, ettől összeroppan Apoláris jelleg csökkentésére módosítják a polimert (pl. szulfonil, piridin stb.) Polaritást növelő módosítások

Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok Eluenserősség Elúciós erő Víz< Metanol<Acetonitril<Etanol<Izopropanol<Tetrahidrofurán Szelektivitás

Az eluensek legfőbb tulajdonságai Tisztaság Viszkozitás Refraktív index Forráspont Toxicitás UV-Cutoff Oldhatóság/elegyíthetőség/oldóképesség

Solvent Miscibility 2-Propanol is an excellent intermediate solvent Name Acetic Acid Acetone Acetonitrile Benzene Butyl Alcohol Carbon Tetrachloride Chloroform Cyclohexane Cyclopentane Dichloroethane Dichloromethane Dimethylformamide Dimethyl Sulfoxide Dioxan Ethylacetate Ethyl Alcohol Di-Ethylether Heptane Hexane Methyl Alcohol Methylethyl Ketone I-Octane Pentane I-Propyl Alcohol Tetrachloroethane Tetrahydrofuran Toluene Di-Propylether Trichloroethane Carbon Tet CH Cl 2 2 DMF DMSO MEK C H Cl 4 THF Water Xylene Immiscible Miscible 2-Propanol is an excellent intermediate solvent

Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok

A pH szerepe az RP-HPLC-ben Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Semleges A pH nem befolyásolja a molekula állapotát, ezért NINCS szükség a pH ellenőrzésére. Semleges vegyületek: Polikondenzált aromások; Halogénezett aromás vegyületek; Alkoholok; Éterek; Ketonok; Aldehidek Stb.

LeChatelier elv A pH szerepe az RP-HPLC-ben Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése. R-COOH  R-COO- + H+ Nemionizált forma (apolárisabb) Ionizált forma (polárisabb-vízoldható) LeChatelier elv Sosem kromatografálunk pH = pKa értéken !!!

A pH szerepe az RP-HPLC-ben Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH k pKa Robusztus Robusztus !!! K’ Nem robusztus !!! pH=2 !!! pH=8 pKa-2 pKa+2

A pH szerepe az RP-HPLC-ben Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Bázikus jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése. R-NH2 + H+  R-NH3+ Nemionizált forma (apolárisabb) Ionizált forma (polárisabb-vízoldható) pKb-2 pKb pKb+2 k Robusztus Robusztus !!! K’ !!! pH=8 !!! pH=2 Nem robusztus pH

A pH szerepe az RP-HPLC-ben Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH kontroll pufferek segítségével történik (csak szükség esetén használjuk, mert csökkentik az állófázis élettartamát!) Puffer koncentrációja (2mM-0,2M tartományban) Gyakran használt pufferek: Foszfát Citrát Trisz(hidroximetil)-aminometán Acetát Formiát Stb.

A pH szerepe az RP-HPLC-ben Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Pufferekkel szemben támasztott követelmények: A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz; Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!); Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése; Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb); A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben; Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel);

Solvent Characteristics (Specifications): Solvent Handling Solvent Characteristics (Specifications): Purity Viscosity Refractive index Boiling Point Toxicity UV Transparency/UV-Cutoff Solubility

Solvent Miscibility 2-Propanol is an excellent intermediate solvent Name Acetic Acid Acetone Acetonitrile Benzene Butyl Alcohol Carbon Tetrachloride Chloroform Cyclohexane Cyclopentane Dichloroethane Dichloromethane Dimethylformamide Dimethyl Sulfoxide Dioxan Ethylacetate Ethyl Alcohol Di-Ethylether Heptane Hexane Methyl Alcohol Methylethyl Ketone I-Octane Pentane I-Propyl Alcohol Tetrachloroethane Tetrahydrofuran Toluene Di-Propylether Trichloroethane Carbon Tet CH Cl 2 2 DMF DMSO MEK C H Cl 4 THF Water Xylene Immiscible Miscible 2-Propanol is an excellent intermediate solvent

Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok

Praktikus tanácsok a HPLC-s oszlopokkal kapcsolatban Avoid any physical stress to the column Close on both ends to avoid dryness Store the column well flushed with the appropriate solvent Record the history of the column

Each column has a defined flow direction! Column Installation Each column has a defined flow direction! The flow direction is shown by the arrow or direction of writing. Don’t change the flow direction, this will decrease column performance.

Equilibrate with mobile phase Do not pressure shock the column. Column Equilibration Equilibrate with mobile phase Do not pressure shock the column. 5-10 column volumes for reversed-phase equilibration. Assures reproducible results.

Column Care and Handling Wash the column after use with selected solvents; flush highly retained sample components from the column. Do not store a column in 100% water. Microbes may grow and clog the column. Don’t open the column and repack the material if you want to maintain performance. Use the column at its optimal flow rate - avoid high flow rates. Do not operate silica or bonded phases for extended periods at high temperature. Keep the pH of the mobile phase in an appropriate range for the column.