Kromatográfiás módszerek

A kromatográfia Többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyűjtőneve. Közös elem: az elválasztandó komponensek az egymással érintkező két fázis között oszlanak meg, ezek közül az egyik áll, a másik pedig meghatározott irányba halad. Állófázis (kolonna, oszlop) Mozgófázis (eluens)

A kromatográfiás módszerek felosztása 1. A szorpciós folyamat szerint: adszorpciós abszorpciós (megoszlásos) ioncsere gél 2. A fázisok halmazállapota szerint

ABSZORPCIÓ/ADSZORPCIÓ Megoszlás a fázisok belsejében Megoszlás a fázisok érintkezési felületén

A kromatográfiás módszerek felosztása 3. Technikai elrendezés szerint oszlopkromatográfia síkkromatográfia papírkromatográfia vékonyréteg kromatográfia 4. Detektálás módja szerint hagyományos műszeres

A KROMATOGRÁFIÁS FOLYAMAT A mozgófázisba impulzus-szerűen bejuttatott minta az állófázisra kerül, ahol a mintakomponensek megoszlási hányadosuknak megfelelően megoszlanak a két fázis között; a valódi egyensúly beállására nincs lehetőség, mivel az egyik fázis mozog. A dinamikus kvázi-egyensúlynak megfelelően eltérő mértékben megoszlott mintakomponenseket a mozgófázis újabb állófázis részre juttatja, ahol ez a kvázi-egyensúly újra beáll. Ez a folyamat újra és újra több fokozatban lejátszódik, amíg minta az oszlop végére nem ér. Az állófázishoz nagyobb affinitású minta-komponensek több időt töltenek el az állófázisban, lemaradnak, míg a kisebb affinitásúak gyorsabban érik el az oszlop végét. A több fokozatúság kis megoszlás-különbségű minta komponensek elválását is lehetővé teszi, a sokszor ismétlődő megoszlási folyamatok eredményeképpen.

A kromatográfia alapfogalmai A kromatogram (elúciós függvény) X tengelyen: idő (elúciós idő) Y tengelyen: a detektorjel intenzitása tR : retenciós idő (komponensenként eltérő - minőségi információ) tM : holtidő tR’ = tR - tM: redukált retenciós idő

A kromatográfia alapfogalmai VR : retenciós térfogat (az adott komponensnek a kolonnán történő átviteléhez szükséges eluens térfogata) VR = v.tR (v: az eluens áramlási sebessége) VM: holttérfogat (= v.tM) ; VS: az állófázis térfogata k’: retenciós tényező (az adott komponens állófázisban (nS) és mozgófázisban (nM) levő anyagmennyiségének aránya) Ezt a megoszlási hányadossal (D) kifejezve

A kromatográfia alapegyenlete VR = VM + D.VS az állófázis térfogata retenciós térfogat holttérfogat megoszlási hányados : szelektivitási tényező (az 1. és 2. komponens egymástól való elválasztására jellemző adat)

A KROMATOGRÁFIÁS SÁVSZÉLESEDÉS ÉS OKAI b) a) a) longit. diffúzió b) örvénydiffúzió c) anyagátadási gátlás a mozgófázisban d) anyagátadási gátlás a mozgófázis álló részében e) anyagátadási gátlás az állófázsban d) c) e)

Az elválasztás hatékonyságának jellemzése: az elméleti tányérszám Kromatogram sávkiszélesedésének okai: longitudinális (hosszirányú) diffúzió örvénydiffúzió (visszakeveredés) anyagátadási gátlások (álló- és mozgófázisban, illetve a mozgófázis állórészében) N: elméleti tányérszám (a kolonna hatékonyságát jellemzi) ( = W1/2.4)

Az elválasztás hatékonyságának jellemzése: a felbontás R: felbontás (két komponens egymástól való elválasztásának hatásosságát jellemzi) (R = 1-nél az átfedés kb. 2%, általános követelmény R > 1,5) Az elválasztás befolyásolása: általában a D változtatásával hőmérséklet (T nő, tR csökken) állófázis fizikai-kémiai tulajdonságai állófázis mennyisége

KROMATOGRÁFIÁS FELBONTÁS

Az elválasztás hatékonyságának jellemzése: a felbontás R: felbontás (két komponens egymástól való elválasztásának hatásosságát jellemzi) (R = 1-nél az átfedés kb. 2%, általános követelmény R > 1,5) Az elválasztás befolyásolása: általában a D változtatásával hőmérséklet (T nő, tR csökken) állófázis fizikai-kémiai tulajdonságai állófázis mennyisége

A FELBONTÁS ÉS BEFOLYÁSOLÁSA Kiindulás k’ változtatása (az eluens oldószererősségével) a retenciós paraméter jelentősen változik, ha k’ nő, az elválasztás javul, retenciós idő nő, csúcsmagasság csökken N növelése (oszlop hossza, áramlási sebesség, töltet) csúcsok keskenyebbek, csúcsmagasság nő, időtartam változhat a változtatása (az álló- és mozgófázis összetételével) az egyik csúcs a másikhoz képest eltolódik, időtartam, csúcsmagasság változik

A FELBONTÁS ÉS BEFOLYÁSOLÁSA

A kromatográfia kinetikus (sebességi) elmélete van Deemter egyenlet (tapasztalati összefüggés): H = A + B/u +C.u H: elméleti tányérral ekvivalens oszlopmagasság (~1/N) u: eluens áramlási sebessége A, B, C: állandók A: az oszlop geometriájának hatása B: longitúdinális diffúzió C: anyagátadással szembeni gátlás hatása H minimális értéken (N maximális értéken) tartása szükséges

A SÁVSZÉLESEDÉS CSÖKKENTÉSE H = A + B/u + Cu Optimális áramlási sebesség: elég nagy ahhoz, hogy a longitudinális diffúzió már ne okozzon jelentős sávszélesedést, de nem olyan nagy, hogy az anyagátadási gátlási folyamatok jelentős sávszélesedést okozzanak Egyenletes szemcseméretű töltet, optimális tömörség

AZ ÁLTALÁNOS ELÚCIÓS PROBLÉMA A retenciós idővel a sávszélesedés egyre nő, ami rontja a meghatározhatóságot. Az eluens erősségét az elúció folyamán szakaszosan vagy folyamatosan növeljük (a k’ növelése) Folyadékkromatográfia: a mozgófázis összetételét változtatjuk Gázkromatográfia: a hőmérséklet változtatása

A kromatogramok értékelése Minőségi elemzés 1. Retenciós idők összehasonlítása előzetes információ szükséges a minta összetevőiről homológ sorok módszere (n ~ lg tR’) Kováts-féle retenciós index 2. Szelektív detektorok kémiai azonosítás, pl. funkciós csoport szerint on line detektálás (mérési és detektálási idő összemérhető) tömegspektrométer, IR spektrométer, ICP AES

A kromatogramok értékelése Mennyiségi elemzés a kromatográfiás csúcs alatti terület arányos a csúcshoz tartozó komponens koncentrációjával A detektálás jellegzetes paraméterei lineáris tartomány érzékenység (meredekség) háttér szórása (zaj) kimutatás alsó határa mérhető legkisebb anyagmennyiség

A DETEKTOROK ÉRZÉKENYSÉGE Az a érzékenység függ az anyagi minőségtől a kromatográfiás elrendezéstől (készülék, kísérleti körülmények)

A kromatogramok értékelése Mennyiségi elemzés módszerei 1. Belső normalizálás - a csúcsterületet az összes csúcs területének %-ában fejezzük ki csak akkor alkalmazható, ha a detektor mindegyik komponensre azonos érzékenységű 2. Kalibrációs módszer kalibrációs függvényt minden komponensre külön meg kell határozni időigényes, de pontos az extrapoláció kerülendő, a kalibrációs görbén csak interpolálni szabad.

A kromatogramok értékelése Mennyiségi elemzés módszerei 3. Addiciós módszer két meghatározást végzünk azonos körülmények között 1. ismeretlen minta mi ~ A1 2. ismeretlen minta + a k. komponens ismert mennyisége (mi + mk) ~ A2 4. Belső standard módszer a vizsgálandó mintához olyan anyagot (belső standardot) adunk, amelyet a minta nem tartalmaz, de jól elváló jelet ad, és ehhez viszonyítjuk a minta-komponensek által szolgáltatott jeleket. Előzetesen meg kell határozni a minta-komponensek belső standardra vonatkozó relatív érzékenységét.

A kromatográfok elvi felépítése Minta adagoló Eluens tároló Eluens továbbító (pumpa) Oszlop (kolonna) Detektor Jel feldolg. termosztált rész