Őssejtek Stem cells Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet, Budapest Semmelweis University, Department of Human Morphology and Developmental Biology Budapest

Ebben a kísérletben bizonyosodott be, hogy differenciált sejtjeink mindegyike tartalmazza azokat az információkat, amik az egész egyed létrehozásához szükségesek

Cloned mammals, whose nuclei came from adult somatic cells devbio8e-fig-04-08-1.jpg Ian Wilmut

Dolly története: testi sejtből létrehozható új egyed, s ez már nem csak a békákra érvényes Dolly (5 July 1996 – 14 February 2003) was a female domestic sheep, and the first mammal to be cloned from an adult somaticcell, using the process of nuclear transfer.[2][3] She was cloned by Ian Wilmut, Keith Campbell and colleagues at the Roslin Institute, part of the University of Edinburgh, Scotland, and the biotechnology company PPL Therapeutics, based near Edinburgh. The funding for Dolly's cloning was provided by PPL Therapeutics and the Ministry of Agriculture.[4] She was born on 5 July 1996 and died from a progressive lung disease 5 months before her seventh birthday.[1] She has been called "the world's most famous sheep" by sources including BBC News and Scientific American.[5][6] The cell used as the donor for the cloning of Dolly was taken from a mammary gland, and the production of a healthy clone therefore proved that a cell taken from a specific part of the body could recreate a whole individual. On Dolly's name, Wilmut stated "Dolly is derived from a mammary gland cell and we couldn't think of a more impressive pair of glands than Dolly Parton's".[1] WIKI

Klónozás Magyarországon Klonilla (fekete egér) az első Magyarországon testi sejtből klónozott egér Klonilla és gyermekei http://www.abc.hu/dinnyes/hirek.htm

Transgenic animals, knockout animals

az őssejteket tenyészetben lehet tartani, szaporítani és genetikailag módosítani knock-out egér mutáns 8

Stem cells What are stem cells? Stem cells are unspecialized cells that have two defining properties: the ability to differentiate into other cells and the ability to self-regenerate. The three broad categories of stem cells are: embryonic stem cells, derived from blastocysts, adult stem cells, which are found in adult tissues, and cord blood stem cells, which are found in the umbilical cord. Multipotent tissue stem cells

MIK AZ ŐSSEJTEK? Olyan sejtek, amelyek más sejtek létrehozására képesek Korlátlan osztódó képességgel rendelkeznek = ez az önmegújulás Eredetük szerint lehetnek: embrionális vagy felnőtt őssejtek A felnőtt őssejtek szövetspecifikusak: pl. hematopoetikus, idegi, izom őssejtek A végdifferenciált sejtek nem osztódnak, de általában folyamatosan pótlódnak a szövetspecifikus őssejtekből, vagy az ezekből származó progenitor/prekurzor sejtekből. Így a szövetspecifikus őssejtek a szöveti regeneráció forrásai. Vannak tumor őssejtek is

Potency of the stem cell. Totipotent stem cells are produced from the fusion of an egg and sperm cell. Cells produced by the first few divisions of the fertilized egg are also totipotent. These cells can differentiate into embryonic and extraembryonic cell types. Pluripotent stem cells are the descendants of totipotent cells and can differentiate into cells derived from any of the three germ layers. Multipotent stem cells can produce only cells of a closely related family of cells (e.g. hematopoietic stem cells differentiate into red blood cells, white blood cells, platelets, etc.). Unipotent cells can produce only one cell type, but have the property of self-renewal which distinguishes them from non-stem cells.

Totipotens őssejtek Totipotent stem cells Pluripotens (embrionális) őssejtek / Pluripotent (embryonic) stem cells

Embrionális őssejtek (ES: embryonic stem cell) Pluripotens (izom, ideg, csírasejt létrehozására is képes) ICM eredetű (blastocysta) Önmegújító képesség Tápláló sejtrétegen tenyészedényben fenntartható Először egérből Evans és Kaufman (1981) Majd humán ES sejtek (Thompson et al. 1998) http://stemcells.nih.gov/info/scireport/pages/appendixc.aspx

As development proceeds, there is a loss of potential and a gain of specialization, a process called determination

Hematopoietic stem cell Multipotens (szöveti) őssejtek Multipotent (tissue) stem cells szöveti (szomatikus) őssejt – a már kialakult, érett szövetben található, önmegújításra és az adott szövet sejtjeinek képzésére (differenciálódás) is alkalmas sejt (multipotens) tissue (somatic) stem cell (multipotent) - cells of the differentiated tissue - ability of self-renewal and differentiation Vérképző őssejt Hematopoietic stem cell

Az őssejtek a stróma jelektől függenek Az aszimmetrikus sejtosztódás eltérő utódsejteket eredményez

Stem cells are dependent from the stroma signals Asymmetric cell division results in different daughter cells stem cell stroma cell stem cell is divided 1. asymmetric division: the daughter cells are different after mitosis - differences in the cytoplasm dividing cell stem cell stroma cell 2. asymmetric division: the daughter cells become different due to environmental factors differentiation or apoptosis stem cell

Sejtek elhelyezkedése és viszonya az epidermiszben A Wnt gátolja az őssejt átmeneti sejtté alakulását Az őssejt jelleget szabályozó faktorok: EGF, FGF, Wnt, Hedgehog, Notch, BMT/TGF, integrin jel utak A dermis papillák csúcsán levő őssejtek a köztes zónákban átmeneti osztódó sejteket hoznak létre, amelyek a papillák között differenciálódnak és a felszínre vándorolnak

Cells in the epidermis Wnt inhibits the transition from the stem cell Factors influencing the stem cell behavior: EGF, FGF, Wnt, Hedgehog, Notch, BMT/TGF, integrin

Cell renewal in the gut epithelium

Hematopoietic stem cells generate a hierarchy of differentiation. Pluripotent stem cells reproduce to give rise to the myloid cells (the erythrocytes (RBC) and the leukocytes (WBC) - eosinophils, neutrophils, basophils, monocytes and megakaryotes) and the lymphoid cells (B and T lymphocytes). Initially pluripotent, the stem cell first becomes committed to either the lymphoid or myeloid lineages. This is followed by rounds of replication and further commitment to give the final 8 cell types. This occurs in the bone marrow and is regulated by growth factors and cytokines.

Plasticity of stem cells of the red bone marrow liver Plasticity of stem cells of the red bone marrow cirrosis Stroke brain skeletal muscle bone marrow bone blood cells muscle dystrophy Leukaemia, lymphoma... bone marrow stroma vessel Epithel cells adypocyte cardiac muscle neuron Neurodege- nerative diseases Myocardial infarctus glia cells

Stem cells in the brain Bulbus olfactorius In the ventricles (mediolateral wall), in the hippocampus

Őssejtek a vázizmokban http://www.phar.cam.ac.uk/research/pell/research

Őssejtek izolálása terápiás célokra: lehetőségek Köldökzsinór vér: hemopoietikus és mesenchymális őssejteket tartalmaz

Milyen betegségeket lehet kezelni? Egy sejttípus/sejtvonal funkcionális kieséséből adódó betegségek A csontvelő átültetés– évtizedes gyakorlat Parkinson-kór – dopamin előállításáért felelős sejtek, lehetséges embrionális és szöveti őssejtből is IDDM – inzulin dependens diabétesz – hasnyálmirigy vagy máj eredetű sejtek in vitro inzulintermelő sejtekké differenciálódnak Az epidermisz őssejteket bőrsérülések javítására használják (átmeneti plasztik takaró véd, amíg az őssejteket kitenyésztik) izomdisztrófiák, szívinfarktus (kardiomiociták)

Which diseases may be treated with stem cells? diseases caused by the lack of one cell type bone marrow transplantation Parkinson disease – replacement of dopaminergic cells IDDM – inzulin dependens diabetes mellitus – replacement of insulin producing cells Epidermis stem cells for skin injuries muscle dystrophy, myocardial infarct

Az őssejtkutatás távlatai Őssejtek alkalmazása a klinikumban - sejttranszplantáció Az egyedfejlődés és a génszabályozás kutatása Gyógyszerkutatás és toxicitási vizsgálatok Tenyésztett pluripotens őssejtek (embrionális vagy szöveti) Az őssejtkutatás távlatai Sejtek/szövetek terápiás céllal Csontvelő Idegsejtek Szívizom Pancreas sejtek

Pluripotens embrionális eredetű őssejtvonalak létrehozása -Korai embryóból nyerhetők -mesterségesen tenyészedényben fenntarthatók -lefagyasztható hosszú évekre. Alkalmas különböző szövetek létrehozására. ICM csomó ICM Letapadt ICM csomó ICM trofektoderma tápláló sejt réteg (egér fibroblaszt) blastociszta tripszin mLIF, DMEM, 20%FCS tripszin ES sejt kolónia ES sejt kolónia ES sejt kolóniák ES sejt kolóniák 33 33 33

Pluripotent embryonic stem cell lines - obtained from early embryo - in culture - can differentiate to different tissue types on culturing cell layer ICM ICM Letapadt ICM csomó ICM trophectoderma cell layer blastocysta tripsin mouse fibroblast whole embryo tripsin mLIF, DMEM, 20%FCS tripsin ES sejt kolónia ES cell colony ES cell colonies 34

transkription faktors Puripotent embryonic stem cells (ES) Alkalik phosphatase staining Oct4 andNANOG transkription faktors SSEA1 antigen

Az Oct-4 és Sox-2 transzkripciós faktorok a blastocysta belső sejtcsomójában (ICM) expresszálódnak OCT4 (green) protein is localized in inner cell mass.  Developmental stages of preimplantation mouse embryos immunostained for Sox2 

Induced pluripotent stem cells

transzkripciós faktorok Oct4 és NANOG transzkripciós faktorok

Hogyan készítsünk iPC sejteket?

Az Oct-4 és Sox-2 transzkripciós faktorok pluripotencia faktorok, szükségesek a transzkripcióhoz a korai elkötelezetlen sejtekben „the combination of OCT4, SOX2 and NANOG binding is critical for transcription in ES cells and likely plays an important role for embryogenesis by binding at conserved early developmental enhancers” Model for “gene regulatory hotspots”.(A) Enhancers are bound by OCT4, SOX2 and NANOG together with p300 in embryonic stem cells. These enhancers maintain pluripotency by activating gene expression in ES cells (top) or poisoning expression for activation after differentiation (bottom) (B) After differentiation of the cell, the same enhancers are bound by p300 in developmental tissues together with other transcription factors. The target gene is expressed. We propose that enhancers which recruit multiple transcription factors in different stages of development are gene regulatory hotspots which are crucial to connect the regulatory networks of pluripotency and development. These enhancers show higher sequence conservation compared to individual, isolated binding events which active in single cell types.

Mi történik az „újraprogramozásnál”? ES cell transcription factor network and implications for reprogramming Yamanaka method: Myc disrupts chromatin OCT4 and Sox2 restore the pluripotency Klf4 cofactor and apoptosis inhibitor Zwaka, T.P. Nature. 2010;467:280 Hochedlinger, K. et al. Development 2009;136:509-523