Disszekciós eljárások Szövet-szeletek Explantátum - biopszia Megőrzött szövet-struktúra (legalább a kiültetés pillanatában) 3. Kézi mikrodisszekció Biopszia
LCM=laser captured microdissection friss fagyasztott szöveten alkalmas szelektív sejt-izolálásra; molekuláris összetevők elemzésére Leica Kritikus tényezők: jól választott szövetrész, kivágott szövet „elkapásának” módszere, molekuláris integritás megőrzése
Sluka , et al., Progress in Histochemistry and Cytochemistry;2008
Szövet-disszociáltatás: szövetből sejtszuszpenzió Módszer kiválasztása szövet típus – ECM aránya; állaga; - Sejtkapcsolatok típusa, aránya, erőssége szövet kora kinyerendő sejttípus I. Mechanikus szövet-disszociáltatás Csak laza – pl. Lép vagy korai embrionális – szövetek esetén 1. A szerv aprítása (~ mm-es darabkák) fiziológiás oldatban 2. Triturálás (szűk [100-400 um] kapilláris-nyíláson át; Emelt viszkozitású (szérum; BSA) fiziológiás oldatban 3. Szűrés (40 – 120 um pórusméretű háló) vagy elkülönítő centrifugálás (sejtek csapadékba ülepíthetők 200 – 400 g; 10 min) http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/
Törmelék összetapadását gátolja II. Enzimatikus disszociáltatás Ca2+ gátolja Ca2+ szükséges Törmelék összetapadását gátolja Worthington; http://www.tissuedissociation.com
Szilárd szövetek disszociáltatása sejtekre - példák
Sejtszámlálás Sejtszámláló kamra Áramlásos sejtszámoló berendezések
Szövetből nyert „primér” sejtszuszpenziók: heretogén sejt-preparátumok Embrionális szövetek: gyors agregáció! E19 patkány kisagyból nyert sejtszuszpenzió Egér lép dendritikus sejtek
fizikai- kémiai paraméterek alapján biospecifikus sajátságok alapján Sejtszeparálás fizikai- kémiai paraméterek alapján biospecifikus sajátságok alapján - szűrés - ülepítés - differenciál-centrifugálás - sűrűség-gradiens centrifugálás - elutriáció - áramlási citometria (FACS) - szelektív sejtadhézión alapuló sejtszeparálás: - sejt affinitás kromatográfia, - panning - mágneses elválasztás - sejtszeparálás szelektív lízissel - sejtszeparálás szelektív előnyök biztosításával
minta ~ Sejtszeparálás fizikai- kémiai paraméterek alapján szeparálás méret és alak alapján szeparálás sűrűség alapján Szedimentációs sűrűség-gradiens centrifugálás Egyensúlyi sűrűség-gradiens centrifugálás pl vérsejt izolálás minta oldat-rétegek sűrűsége ~ részecskék sűrűsége a részecskék sűrűsége nagyobb, mint az oldat-rétegeké emlős sejtek fajsúlya ~ 1,06 g/cm3 Idő!! ha túl sokáig centrifugálunk, minden a csapadékba kerül! részecke a rá jellemző sűrűségtartományban marad
mononukleáris sejtek polimorfonukleáris sejtek (granulociták) vvt
Centrifugal Elutriation (CE) Centrifugal elutriation: Sedimentation takes place in the presence of field flow. CE is also called counterstreaming centrifugation; counterflow centrifugation ; counterflow centrifugal elutriation (CCE)
Mágneses sejt szeparálás
Fluorescence Aided Cell Sorter - FACS
Side population: Hoechst 33342 efflux (ABCG2) Primitív (pluripotens) őssejtet azonosítja Side population: Hoechst 33342 efflux (ABCG2)
BD FACS Vantage SE BD FACSort