Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása.

Az előadások a következő témára: "Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása."— Előadás másolata:

1 Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása

2 Obligát anaerob mikroorganizmusok Obligát anaerobnak nevezünk egy mikroorganizmust, ha az csak anaerob viszonyok között képes létezni. Abból adódik az obligát jellege, hogy nem rendelkezik kataláz enzimmel. A kataláz enzim segítségével bontaná az oxigén jelenlétében keletkező peroxidot, ami méreg számára. 2O 2 - + 2H +  szuperoxid dizmutáz  H 2 O 2 + O 2 H 2 O 2  kataláz  H 2 O + ½ O 2 E két jellemző reakció hiányzik az obligát anaerob mikroorganizmusok esetén.

3 Obligát anaerob mikroorganizmusok fontossága A kizárólag anaerob mikroorganizmusok a talaj alsóbb oxigénhiányos rétegeiben helyezkednek el az aerob és a fakultatív anaerob életterek alatt. Életfunkcióik fenntartásához anaerob oxidációval nyernek energiát. Ez többféle vegyület jelenlétében lehetséges. Ezek szerint beszélünk nitrátlégzésről, szulfátlégzésről és karbonátlégzésről. A környezetbe kerülő szennyezések lebontásához az effajta légzésüket használjuk fel, mely során a szennyezőanyagok oxidálásával nyerik a szükséges energiát, miközben azok lebomlanak vagy kevésbé veszélyes, könnyebben bontható termékekké alakulnak.

4 Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása Egy környezeti elemben, esetünkben a talajban bekövetkező szennyezés elhárítása esetén rövid idő alatt és nagy mennyiségben kellene a lebontást végző mikroorganizmusoknak elszaporodnia. Ezen mikroorganizmusoknak talajban való jelenlét monitorozzuk a felszaporítás segítségével. Az eljárás a mikroorganizmusok talajmintából való könnyebb izolálását teszi lehetővé, mivel az izoláláshoz kellő számú mikroorganizmusra van szükségünk. Ha nincs kellő számú lebontást végző mikroba a talajban, akkor előre felszaporított formában juttathatunk a talajba, a lebontás meggyorsítása érdekében.

5 Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása A felszaporítás általában laboratóriumi körülmények között zajlik. A következőkben néhány obligát anaerob mikroorganizmus felszaporítását mutatom be részletesen.   Szulfát redukálók   CO 2 redukálók   Cellulóz lebontó Clostridia felszaporítása

6 Szulfát redukálók felszaporítása A szulfát redukálók obligát anaerob baktériumok, melyek az anaerob talajban és vízben fordulnak elő. Heterotrófok és hexózokat, alkoholokat, szerves savakat hasznosítanak szénforrásként. A szulfát mellett a szulfitot és a tioszulfátot is kénhidrogénné redukálja.

7 Szulfát redukálók felszaporítása A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok:   0,2 %-os NaCl oldat 0,2 g NaCl-ot 80 ml desztillált vízben feloldva, majd 100 ml-ig szintén desztillált vízzel jelre töltve és autoklávozva készül.   Só oldat hozzávalói 0,5 g K 2 HPO 4 1,0 g NH 4 Cl 1,0 g CaSO 4 2,0 g MgSO 4.7H 2 O 5,0 g Na laktát (70% m/m) 10,0 g agar 930,0 ml desztillált víz Az oldat pH-ját 8,1-re állítjuk.

8   Vas-ammónium-szulfát [FeSO 4 (NH 4 ) 2.6H 2 O] oldat FeSO 4 (NH 4 ) 2 SO 4.6H 2 O oldat 3 egymást követő napon át tartó, napi 1 órás gőzölésével készül.   Élesztő kivonat-oldat 10%-os oldatot készítünk és autoklávozzuk.   Nátrium-tioglikolát oldat (10%)   Tápoldat, 1 l Autoklávozzuk az oldatot, lehűtjük, majd anaerob steril fülkében dolgozunk. 50 ml sterilszűrt vas-ammónia-szulfát oldatot, 10 ml élesztő kivonat-oldatot és 10 ml nátrium- tioglicerát oldatot adunk hozzá, majd a só oldathoz adagoljuk. Állítsuk be a végső pH-t 7,2-7,6 közé. Végül porciózzuk a táptalajt steril kémcsövekbe. Szulfát redukálók felszaporítása

9 Az eljárás A talaj mintával anaerob steril fülkében dolgozzunk, először szuszpendáltassuk NaCl oldatban. Készítsünk 1:10-es hígítást NaCl oldattal és oltsuk be a kémcsöveket 0,1-1,0 talaj szuszpenzióval. A legalább 4 hetes inkubációs periódus után válnak láthatóvá a szulfát redukáló baktérium telepek. Szulfát redukálók felszaporítása

10 A szén-dioxid redukálók szintén obligát anaerob baktériumok. A következő reakciót katalizálják: H 2 +CO 2  CH 4, acetát Csak vízzel elárasztott anaerob talajokban találhatók. Szén-dioxid redukálók felszaporítása

11 A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok:   Vitamin oldat 1000,00 ml desztillált víz 2,00 mg biotin 2,00 mg folsav 10,00 mg piridoxin-hidroklorid 5,00 mg tiamin-hidroklorid 5,00 mg ribiflavin 5,00 mg nikotinsav 5,00 mg kalcium-pantotenát 0,01 mg B 12 vitamin 5,00 mg p-aminobenzoesav 1,00 mg liposav 4 o C-on tárolva. Szén-dioxid redukálók felszaporítása

12   Ásványi oldat 0,50 g Titripex I 6,20 gMgSO 4.7H 2 O 0,55 g MnSO 4.7H 2 O 1,00 g NaCl 0,10 g FeSO 4.7H 2 O 0,17 g CoCl 2.6H 2 O 0,13 g CaCl 2.2H 2 O 0,18 g ZnSO 4.7H 2 O 0,05 g CuSO 4.7H 2 O 0,018 g AlK(SO 4 ) 2.5H 2 O 0,010 g H 3 BO 3 0,011 g Na 2 MoO 4.2H 2 O Szén-dioxid redukálók felszaporítása

13   Redox közeg 165,5 ml desztillált víz 15,5 ml NaOH (1 M) 2,5 g cisztein.HCl.H 2 O 2,5 g Na 2 S.9H 2 O A NaOH-ot hígítsuk vízzel és óvatosan forraljuk fel O 2 mentes nitrogén bevezetése mellett. Majd hűtsük jégen, adjuk hozzá a ciszteint és a Na 2 S-t, végül 4 hétig szobahőmérsékleten 250 ml-es edényekben autoklávozzuk. Ebből adjunk 1 ml-t a tápoldat 100 ml- éhez. Szén-dioxid redukálók felszaporítása A Titriplex I-t oldjuk fel 10 ml NaOH (0,5 M)-ban és hígítsuk desztillált vízzel 500 ml-ig. Oldjuk fel a sókat is az oldatban és hígítsuk tovább 1000 ml-ig.

14   Resazurin oldat 0,1 g resuzarint feloldunk 100 ml desztillált vízben és az oldatot átszűrjük sterilszűrőn.   Hígító folyadék 1,0 g NH 4 Cl 0,1 g MgSO 4.7H 2 O 0,4 g K 2 HPO 4 0,4 g KH 2 PO 4 2,0 ml resazurin oldat 40,0 ml redox közeg Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben és töltsük jelre 1000 ml-ig. Szén-dioxid redukálók felszaporítása

15   Brómkrezol zöld agar 100 ml desztillált víz 1 g agar 0,01 g brómkrezol   Tápanyag oldat 950,00 ml desztillált víz 1,00 ml resazurin oldat 1,0 g NH 4 Cl 0,68 g KH 2 PO 4 0,87 g K 2 HPO 4 0,04 g MgSO 4.7H 2 O 20,00 ml vitamin oldat 20,00 ml ásványi oldat 2,00 g élesztő kivonat 10,00 g NaHCO 3 Szén-dioxid redukálók felszaporítása

16 Állítsuk be a pH-t 7,8-ra, majd fokozatosan forraljuk fel a tápanyagot oldatot N 2 /CO 2 (80%/20%) áram bevezetése közben. A hűtés után adjunk hozzá, 0,5g cisztein.HCl.H 2 O- t és 0,25 g Na 2 S.9H 2 O-t. Folyamatos gázkeverék áram mellett részletekben (100 ml) töltsük ki a tápanyag oldatot lapos üvegekbe, majd autoklávozzuk 120 o C-on 30 percig. A lehűlés után, ha szükséges újból állítsuk be a 7,8-as pH- t. Szén-dioxid redukálók felszaporítása

17 Az eljárás Anaerob, steril körülmények között (fülkében) szuszpendáltassunk 1 g talajt 10 ml hígító folyadékban. Egyenletes oszlassuk el 0,1 ml-es részleteit ezeknek a hígításoknak az agaron, folyamatos 67%-os H 2 és 33%-os CO 2 áram mellett. Zárjuk az üvegeket és inkubáljuk 37 o C- on néhány hétig. A metanogén és acetogén baktériumok megkülönböztetésére óvatosan öntsünk 5 ml-t a brómkrezol zöld agar oldatból a telepek tetejére. A sav- termelő telepek és a környékük sárgává fognak válni körülbelül 1 óra után, miközben a CH 4 termelő telepek kékek maradnak. Szén-dioxid redukálók felszaporítása

18 A Clostridia obligát anaerob spórás baktérium, melynek elsődleges élőhelye a talaj. Szén és energiaforrásként cukrot, keményítőt, pektint, aminosavakat, szerves savakat, fehérjét és cellulózt egyaránt hasznosít. A cellulóz lebontó baktériumoknak kiemelt szerepe a növényi maradványok lebontásában, mivel azok egyik fő alkotóeleme a cellulóz. Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

19 A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok:   Cellulóz szuszpenzió Tegyünk felaprított cellulóz és Nátrium-karboxi-cellulóz keveréket desztillált vízbe, hogy 2%-os (m/V) szuszpenziót alkossanak.   Hígító folyadék 1,0 g ammónium-szulfát 0,1 g MgSO 4.7H 2 O 2,0 g NaCl 0,1 g CaCl 2 1,3 g K 2 HPO 4 0,7 g KH 2 PO 4 Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben az összetevőket, állítsuk be a pH-t 7,0-ra, majd töltsük fel 1000ml-ig desztillált vízzel és autoklávozzuk.

20   A típusú só oldat 1 g ammónium-szulfát 2 g NaCl 13 g K 2 HPO 4 Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben az összetevőket, állítsuk be a pH-t 7,0-ra, majd töltsük fel 1000ml-ig desztillált vízzel és kevertessük autoklávval.   B típusú só oldat 50,00 ml desztillált víz 0,05 g MgSO 4.7H 2 O 0,05 g CaCl 2 Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

21   Resazurin oldat 0,1 g resuzarint oldjunk fel 100 ml desztillált vízben és szűrjük át sterilszűrőn.   Tápoldat 500 ml A típusú só oldat 200 ml cellulóz szuszpenzió 250 ml desztillált víz 1 ml resazurin oldat 15 g agar 1 g élesztő kivonat Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

22 Összekeverés után 1000 ml-ig töltsük fel desztillált vízzel, majd autoklávozzuk. Hűtés után (45 o C), anaerob tartályban tároljuk. Oldjunk fel 0,5 g Cisztein.HCl-t 50 ml B típusú só oldatban, majd sterilre szűrjük és adjuk hozzá a tápoldathoz. 45 o C-on, steril anaerob tartóban tároljuk szétporciózva. Az eljárás A talajmintával anaerob steril fülkében dolgozzunk. Először szuszpendáljuk 1 g-ját 10 ml hígító oldatban, majd oltsuk be az összes meleg agar csészét 0,1 ml szuszpenzióval (pár csészét csak hígító oldattal). Oszlassuk szét, hagyjuk megszilárdulni és inkubálni 28-35 o C-on. A cellulóz-bontó baktérium növekedését a cellulóz agar tisztulása fogja jelezni. Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

23 Forrás: Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995