Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Ureáz aktivitás mérése Készítette: Majoros Katalin.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Ureáz aktivitás mérése Készítette: Majoros Katalin."— Előadás másolata:

1 Ureáz aktivitás mérése Készítette: Majoros Katalin

2 Bevezetés  Az enzimek biológiai katalizátorok, melyek alapvető szerepet töltenek be a sejtek anyagcsere folyamataiban. Az enzimek is, mint minden katalizátor, csak olyan folyamatok lejátszódását segítik elő, amelyek egyébként is végbemennének, de a reakció lényegesen lassabban játszódna le. Egy adott kémiai reakció sebességét képesek növelni azáltal, hogy csökkentik annak aktiválási energiáját.

3 Az enzimek  Az enzimek felépítésüket tekintve fehérjék, emiatt működésük erősen függ a hőmérséklettől és a pH-tól, mindegyikre jellemző egy hőmérséklet- és pH-optimum  Az enzimek fajlagosan működnek, vagyis specifikusak: csak egy adott vegyület (vagy vegyületcsoport, a szubsztrát) adott reakcióját katalizálják, amely képes a kérdéses fehérje térszerkezetéből és energetikai viszonyából adódóan ahhoz kapcsolódni az ún. aktív centrumon.  Az enzimfehérjék térbeli szerkezete az, ami lehetővé teszi a reagáló anyagokkal való kapcsolat kialakítását, azok megkötését. A fehérjék ezen részét nevezzük aktív centrumnak.

4 Ureáz  Az ureáz a karbamid hidrolízisét katalizáló enzim.  Megtalálható magasabb rendű növényekben és mikroorganizmusokban. Jelenléte teszi lehetővé a karbamidnak, mint nitrogénforrásnak a felhasználását.  Csak bizonyos környezeti feltételek mellett működik hatékonyan. Aktivitását befolyásolja a hőmérséklet és a kémhatás. Optimális pH tartománya 8,5-9 közötti.  A baktériumok az ureáz enzim segítségével bontják a húgysavat, miközben ammóniát szabadítanak fel.

5 Az ureáz működése és aktivitásmérése  Mint már említettem, az ureáz katalizálja a húgysav hidrolízisét szén-dioxidra és ammóniára, karbamid képződése közben.  A reakció egyenlete:  H 2 NCONH 2 + H 2 O =2NH 3 + CO 2  Sokféle módszert fejlesztettek ki az ureáz aktivitásának mérésére talajmintákból  Legtöbbjük magában foglalja a toluollal kezelt, pufferelt húgysavoldattal átitatott talajmintából felszabaduló ammónia mennyiségének mérését  Más módszerek inkább a felszabaduló szén-dioxid mennyiségéből következtetnek a talajmintában történő húgysavhidrolízis mértékére  Megint mások sem toluolt, sem puffereket nem alkalmaznak a mérésekhez

6 Nehézségek a meghatározásban  A sokféle módszer miatt eltérőek a vélemények a pH- optimumot, illetve az optimális hőmérséklettartományt tekintve is:  pH-ra a semlegestől a 6-7 tartományon át, a es értékekig találhatók irodalmi adatok  Optimális hőmérsékletre 60°C adódott, de az ureáz általában 70°C-on denaturálódik, a talajminták inkubációjának hőmérséklete 15-40°C tartományban végezhető ( a 30°C az ideális)  Ráadásul az ureáz aktivitás nem arányos a mikrobiális biomasszával, és hatását a nehézfémek, az oxigén koncentráció, a bontható nitrogénmennyiség mind-mind befolyásolja  A továbbiakban két meghatározási módszert vizsgálunk részletesebben, melyek eltérő módon juttatnak (remélhetőleg) ugyanahhoz az eredményhez.

7 Tabatabi és Bremner ureáz aktivitás meghatározási módszere (1972) I.  A módszer lényege: Az ammóniafelszabadulás mértékének meghatározásán alapul, miután a talajmintákat 2 órán keresztül 37°C-on, húgysavoldattal inkubáltuk  Eszközök: Gőzdesztillációs berendezés 37°C-ra állítható inkubátor pH mérő Mérőlombikok (50, 100, 1000, 2000 ml) Automata titráló berendezés Erlenmeyer lombik (100 ml)

8 Tabatabai-Bremner (1972) II.- vegyszerek és oldatok  Toluol  Hidroxi-metil-amino-metán puffer (50mM, pH 9) Ebből 6.1 g-ot 700 ml desztillált vízben oldunk, majd addig adagolunk hozzá H 2 SO 4 -ot (0.2M), amíg el nem érjük a 9.0 pH-t. Ezután desztillált vízzel 1000 ml térfogatúra töltjük fel  Húgysavoldat (200 mM) 1.2 g húgysavat 80 ml pufferoldatban oldunk, majd ugyanezzel a pufferrel 100 ml-re töltjük fel. Minden nap friss oldatot kell készíteni és 4°C-on kell tárolni  Kálium-klorid (2.5M)- ezüst-szulfát (100mg/l) oldat Feloldunk 100 mg Ag 2 SO 4 -ot 700 ml desztillált vízben, majd 188g KCl-ot ebben az oldatban és desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel.

9 Tabatabai-Bremner III.- Az NH 4 -N meghatározás reagensei  H 2 SO 4 (0.005 M)  Indikátor oldat Feloldunk 0.66 g brómkrezol zöldet és 0.33 g metilvöröst 95%-os etanolban, és szintén etanollal 1000 ml-re töltjük fel  Bórsavas indikátor oldat A 2 l-es mérőlombikba pipettázunk 40 ml-t az indikátor oldatból, és 400 ml-t a 95%-os etanolból. 40 g bórsavat 1400 ml meleg desztillált vízzel keverünk. Hűtés után ezt is a 2 l-es mérőlombikba öntjük. Ezután addig pipettázunk hozzá NaOH-ot (0.05M), amíg 1 ml oldat színe rózsaszínről zöldre változik 1 ml desztillált víz hozzáadásakor. Végül mindezt 2000 ml-re töltjük fel desztillált vízzel.  MgO °C-on hőkezelünk hőstabil MgO-ot 2 órán keresztül, majd hűtjük és kiszárítjuk NaOH-on vagy szilikagélen exikátorban.  Ammóniastandard oldat Feloldunk g ammónium-szulfátot desztillált vízben, majd 1000ml-re töltjük fel szintén desztillált vízzel

10 Tabatabai-Bremner IV. – A meghatározás menete  5g nedves talajmintát helyezünk az 50 ml-es mérőlombikba, majd hozzáadunk 0.2 ml toluolt és 9 ml pufferoldatot, ezt összekeverjük, és hozzáadunk 1 ml húgysavoldatot, majd ismét keverjük néhány másodpercig.  Ezután az edényt inkubátorba helyezzük ás 2 órán át 37°C-on inkubáljuk.  Ezt követően hozzáadunk a mintához kb. 35 ml KCl-Ag 2 SO 4 oldatot, összerázzuk, majd hagyjuk a lombik tartalmát szobahőmérsékletűre hűlni.  Miután lehűlt, feltöltjük a káliumos oldattal 50 ml-re, és jól elkeverjük az összetevőket.  Ajánlott legalább 3 ismétlést csinálni.  Az ammóniameghatározás menete: 5 ml bórsav indikátort pipettázunk egy Erlenmeyer lombikba, és 20 ml talajminta szuszpenziót egy 100 ml-es desztilláló lombikba. Ehhez hozzáadunk 0.2 g MgO-ot és gőzdesztilláljuk, amíg össze nem gyűlik 30 ml desztillátum. Ezt öntjük majd az Erlenmeyer lombikba az indikátorra. A desztillátumot ezután M-os H 2 SO 4 oldattal titráljuk. 1 ml H 2 SO 4 70 μg NH4-N-nek felel meg.

11 Tabatabai-Bremner V.- Számítás  Miután a standardokkal ellenőriztük a mérési eredményeink helyességét, a következőképpen számolunk:  ureáz aktivitás (μg NH 4 -N g -1 dwt*2h -1 )= (C×50)/(dwt×5)  Ahol C: a mért NH 4 -N koncentráció (1 ml talaj- szuszpenzióban),  dwt: 1 g nedves talajminta száraz tömege,  5: a méréshez használt talajtömeg,  50: a talaj-szuszpenzió teljes térfogata

12 Kandeler és Gerber módszere (1988) I.  A módszer lényege: Az ammónia kolorimetriás meghatározása a talajminta és a húgysavoldat 37°C-on, 2 órán át tartó inkubálása után.  Szükséges eszközök: 37°C-ra állítható inkubátor Rázó Szűrőpapír Spektrofotométer Mérőlombikok (100, 500, 1000, 2000 ml) Erlenmeyer lombik (50, 100 ml)

13 Kandeler-Gerber II. - Vegyszerek és oldatok 1.  Húgysavoldat Oldjunk fel 2.4 g húgysavat 400 ml desztillált vízben, majd töltsük fel 500 ml-ig desztillált vízzel (naponta újat készítünk belőle)  KCl oldat 74.6 g KCl-ot feloldunk desztillált vízben, majd hozzáadunk 10 ml 1M-os HCl-ot, és desztillált vízzel feltöltjük 1000 ml-re.  NaOH (0.3 M) 12 g NaOH-ot oldunk desztillált vízben, majd szintén desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel.  Nátrium-szalicilát oldat 17 g Na-szalicilátot és 120 mg nitroprusszid-nátriumot oldunk desztillált vízben, majd 100 ml-re töltjük desztillált vízzel.  Na-szalicilát/NaOH oldat Egyenlő mennyiségű NaOH oldatot, Na-szalicilát oldatot és desztillált vizet keverünk össze. (naponta újat kell belőle készíteni)

14 Kandeler-Gerber III. – Vegyszerek és oldatok 2.  Nátrium-diklór-izocianid oldat (0.1%) 0.1 g nátrium-diklór-izocianátot oldunk 100 ml desztillált vízben (közvetlenül használat előtt készítjük el)  Borát puffer (pH 10) g dinátrium-tetraborátot, vagy 30g vízmentes dinátrium-tetraborátot oldunk 1500 ml meleg desztillált vízben. Hűlés után annyi 20%-os NaOH-t adunk hozzá, hogy pH-ja 10 legyen, majd 2000 ml-re töltjük fel desztillált vízzel  Ammónium-standard oldat I. oldat:  3.82 g ammónium-kloridot oldunk desztillált vízben, majd 1000 ml-re töltjük (1000μg NH 4 -N/ml)  Az oldat 4°C-on tárolva több hétig stabil marad II. oldat:  0.0, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 ml I. oldatot pipettázunk 100 ml-es mérőlombikokba, majd KCl oldattal 100 ml-re töltjük őket.

15 Kandeler-Gerber III. – A meghatározás menete: a nem pufferelt módszer  5g nedves talajmintát helyezünk a 100 ml-es Erlenmeyer lombikba, és hozzáadunk 2.5 ml húgysavoldatot. Ezt 2 órán át 37°C-on inkubáljuk, majd 50 ml KCl oldat hozzáadása után az egész lombikot 30 percen keresztül rázatjuk. A kapott szuszpenzió szűrése után, a szűrlet ammóniumtartalma mérhető.  Ammónia-meghatározás: 1 ml tiszta szűrletet pipettázunk az 50 ml-es Erlenmeyer lombikba, majd hozzáadunk 9 ml desztillált vizet, 5 ml Na-szalicilát/NaOH oldatot és 2 ml nátrium-diklór- izocianát oldatot, majd 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a 690 nm-en mérjük az optikai denzitást.

16 Kandeler-Gerber III. – A meghatározás menete: a pufferelt módszer - Kalibrálás  5g nedves talajmintát helyezünk 100 ml-es Erlenmeyer lombikba, és hozzáadunk 2.5 ml húgysavat és 20 ml borát puffert.  A további lépések megegyeznek a nem pufferelt változat lépéseivel, de a végén 30 ml KCl-ot adunk hozzá az inkubáció után.  Kalibrálás: 1 ml ammónium standard II. oldatot pipettázunk a kémcsövekbe és 9 ml desztillált vízzel hígítjuk, majd meghatározzuk az ammónium koncentrációkat (0, 1, 1.5, 2, 2.5 μg NH 4 -N/ml)

17 Kandeler-Gerber IV. - Számítás  Számolás: Ureáz aktivitás (μg NH 4 -N g -1 dwt*2h -1 )= ((μg NH 4 -N/ml) × V ×10)/(dwt × 5) Ahol dwt: 1 g nedves talaj száraz tömege V: 52.5 ml, a minta teljes térfogata 10: a hígítási arány 5: a meghatározáshoz használt talaj tömege

18 Megjegyzések  Tabatabaiék módszerében a puffer megakadályozza a NH 4 + ionok kötődését a talajban, így a pufferelt közegben nagyobb ureáz aktivitás adódik, mint a nem pufferelt közegben.  A KCl-Ag 2 SO 4 oldat készítésekor fontos, hogy a KCl-ot oldjuk az ezüst-szulfátban, mert az ezüst szulfát nem oldódik a kálium- kloridban.  Erre az oldatra azért van szükség, hogy megakadályozza az enzimreakciót, így a szuszpenzió tud 2 órát állni ammónium felszabadulása nélkül.  Kandelerék módszerében nem használunk ilyen inhibítort, de a KCl itt is lelassítja a reakciót.  A szűréskor ügyelni kell, hogy a szűrőpapír nitrogénmentes legyen, hogy megelőzzük a nitrogénmegkötődést a szűrletben.  Az ammónium vizsgálathoz előállított színreakció szobahőmérsékleten 8 óráig stabil marad.  A kolorimetriás meghatározás nem ajánlott a sok nehézség miatt, mint a reagensek vagy a színes vegyületek instabilitása, a nehézkes ismételhetőség, az alacsony érzékenység, az alacsony húgysav-koncentrációk, stb.

19 Köszönöm a figyelmet!

20 Források:  Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995  :enzimműködés képek, bevezető az enzimekről  ml :bevezető az enzimekről ml  rease.jpg :ureáz képe rease.jpg  bevezető az ureázról


Letölteni ppt "Ureáz aktivitás mérése Készítette: Majoros Katalin."

Hasonló előadás


Google Hirdetések