Génsebészet Cseh Zsófia.

Az előadások a következő témára: "Génsebészet Cseh Zsófia."— Előadás másolata:

1 Génsebészet Cseh Zsófia

2 A cDNS tárak Plazmidba: 5 kbp DNS, a gamma fágba: 20 kbp DNS klónozható. (Az átlagos baktérium 1 kbp hosszú.) Genom kis része: gének Genom nagy része: intergénikus DNS-szakaszok Nem íródik át: intergénikus, promóter, intron szekvenciák

3 A cDNS tárak Készítése:
Def.: Különféle cDNS-eket vagy cDNS-szakaszokat tartalmazó vektorok összessége. Készítése: 1.) Reverz transzkriptáz enzim az mRNS alapján komplementer szálat szintetizál complementer DNS= cDNS 2.) A teljes cDNS-t vagy annak egyes szakaszait vektorokba klónozzák.

4 Géntárak Olyan vektorok gyűjteménye, amelyek bár kis szakaszokban, de valamely faj teljes genomját tartalmazzák. Vektor: fágok és plazmidok (bakteriális), olyan DNS molekulák, amelyek alkalmasak idegen eredetű DNS szakaszok megsokszorozására. A genomikus géntárat alkotó rövid DNS-szakaszok bármelyike izolálható, és belőle tetszőleges mennyiségű DNS készíthető, használható különböző célokra.

5 Géntárak A génkönyvtárból ki kell tudni választani azt a klónt, amelyre szükség van. A kiválasztott klón szaporítható, majd kinyerhető belőle a nagy mennyiségű, klónozott DNS.

6 Géntárak Géntárak szűrése
1) Idegen DNS-t tartalmazó baktériumkolóniát készítenek. 2) A kolóniából baktériumokat visznek egy nitrocellulóz filterre. 3) A nitrocellulóz filtert NaOH-al kezelik  baktériumok feltárása  DNS denaturálása  egyszálú DNS kötése a filterhez

7 Géntárak 4) A DNS-t 90-95C0-on rásütik a filterre, hogy a DNS ne vesszen el 5) A filtert 32P-vel jelölt próbával inkubálják (vagy fluoreszcens molekulákkal). 6) Inkubáció alatt a próba próba DNS hibridizál a komplementer DNS-szekvenciákkal.

8 Géntárak 7) A nitrocellulóz filtert röntgenfilmmel borítják, így a 32P bomlása során létrejövő béta-sugárzás hatására fotokémiai reakció játszódik le a filmben. fekete ezüstszemcsék jelennek meg a film előhívása során. 8) A szemcsék megmutatják, hogy melyik kolónia tartalmazza a próbával komplementer DNS-szakaszt. 9) A megfelelő baktériumok az eredeti mesterlemezről izolálhatók, elszaporíthatók.

9 PCR (polimerase chain reaction)
10-12 kbp hosszú DNS-szakaszok nagy mennyiségű, in vitro elkészítését teszi lehetővé. Eppendorf-csőbe teszünk: Puffer Primerek Taq-polimeráz enzim dATP, dTTP, dGTP, dCTP

10 PCR Primer: 20-30 pb-ból álló egyszálú, szintetikus oligonukleotid, amely komplementer a templát DNS valamely szakaszával. PCR: Három különböző hőmérsékleten történő folymat ismétlődése.

11 PCR 95 C0 DNS denaturálódása
60 C0 primerek kapcsolódása a komplementer DNS-szekvenciákkal. 72 C0 Taq-pol optimális működési hőmérséklete, komplementer DNS szintézise a primertől kiindulva. Exponenciális növekedés: 1 ciklus DNS kettős spirálok száma megkétszereződik: n db ciklus 2n DNS-spirál (30-40 ciklus)

12 PCR Primer: Olyan rövid szekvenciák, amelyek a sokszorozni kívánt DNS két végével komplementerek és 3’ végük egymás felé néz. Azonos olvadási hőmérséklettel kell rendelkezniük és feltétel, hogy nagy fölöslegben kell legyenek.

13 PCR Taq polimeráz Működési optimuma: 72 C0 Nem károsodik 95C0-on

14 PCR Denaturálás 95 C0 DNS kettős szála felbomlik egyszálú DNS

15 PCR Túlnyúló végek a ligáláshoz

16 PCR

17 PCR

18 PCR RT-PCR: Az mRNS minták alapján először a reverz transzkriptáz enzim szintetizál az mRNS-nek megfelelő DNS-t, majd a kapott DNS –szakasz elszaporíthatő a megfelelő primerekkel.

19 RFLP Restrikciós enzim:
meghatározott szekvenciát ismer fel és vágja el ennek mentén a DNS-t  restrikciós fragmentek képződnek. Restrikciós fragment: hossza egyenlő restrikciós helyek egymástól mért fizikai távolságával. Elkülönítésük: gélelektroforézissel A hosszabb fragmentek rövidebb utat, a rövidebb fragmentek hosszabb utat tesznek meg. Az azonos hosszúak egy sávot képeznek. A sávok helyzete fordítottan arányos a restrikciós fragmentek hosszának logaritmusával.

20 RFLP (restrikciós fragment hosz polimorfizmus)
Gélelektroforézis:

21 RFLP Sávok láthatóvá tétele: 1) DNS-hez kapcsolódó festékkel:
etidium-bromid UV-fényben narancssárgán fluorszkál. 2) DNS/DNS vagy DNS/RNS hibridek kimutatásával, jelzett próbával való hibridizáció útján.

22 RFLP (restrikciós fragment hossz polimorfizmus)
A populációban sok génnek sok allélja létezhet egyidejűleg  a populáció az adott tulajdonságot illetően polimorf. A mutációk restrikciós helyeket szüntetnek meg és újakat hoznak létre, megteremtve a DNS polimorfizmus alapját.

23 RFLP Tkp a DNS polimorfizmusa valamely restrikciós hely meglétét vagy hiányát jelenti a DNS ugyanazon szakaszán a homológ krsz-ák DNS-ében. Ez azt jelenti, hogy a faj különböző egyedeiből származó homológ krsz-ák DNS-ének adott pontján valamely restrikciós hely jelen van-e vagy sem.  Valamely restrikciós enzimmel folytatott emésztés során eltérő hosszúságú restrikciós fragmentek képződnek.  A különféle hosszúságú restrikciós fragmentek eltérő gyakorisággal lehetnek jelen a különböző populációkban.

24 RFLP Minden ember genetikailag egyedi kombináció, egyedi RFLP-mintázat jellemző minden egyes emberre személyek azonosítása. Alkalmas módszer a a krsz-ák jól definiált pontjainak azonosítására. A marker mutációk géneket azonosítanak, viszont az intergénikus szakaszok is bőségesen tartalmaznak restrikciós helyeket.

25 RFLP Alkalmas: Genetikai eredetű tulajdonsá- gok vizsgálata
Prenatális diagnosztika Személyek azonosítása Tájékozódási pontok a krsz-ák mentén

26 Restrikciós endonukleázok
Restrikciós enzimek: azon baktériumok után nevezik el, amelyekből izolálják őket. Pl.: EcoRI (Escherichia coli RY13) EcoRV az (Escherichia coli R)

27 Restrikciós endonukleázok
A baktériumokban kifejlődött restrikciós-modifikációs rendszer felfedezése tette lehetővé az irányított, reprodukálható, in vitro DNS szabás-varrást és a technikán alapuló DNS-klónozást. A restrikciós-modifikációs rendszer két különböző enzimaktivitáson alapszik.

28 Restrikciós endonukleázok
A restrikciós enzimek meghatározott sorrendű bázispárokból álló egységet (palindrom szekvenciák) ismernek fel a DNS-spirál kettős spirálon és a felismerő helyen, vagy annak közelében hasítani képesek a kettősláncú DNS molekulát. A "restrikciós" szó ezen enzimcsoport nevében a baktériumban betöltött szerepükre utal: a restrikciós enzimek feldaraboljak a gazdasejtbe bejutó idegen DNS-t (pl. bakteriofág DNS-e), "restriktív" körülményeket teremtve számukra.

29 Restrikciós endonukleázok
DNS metilázok: Metil-csoportokkal jelölik meg a baktériumok saját DNS-ét a baktérium restrikciós endonukleáza által felismert szekvenciánál. A módosítás lehetetlenné teszi az endonukleázok működését, "védik" a DNS molekulát. A baktériumokba bejutott idegen DNS molekula viszont nincs a megfelelő helyen metilálva, és áldozatul esik az endonukleázoknak.

30 Restrikciós endonukleázok
A génmanipulációs kísérletekben olyan restrikciós endonukleázokat használnak, amelyek reprodukálhatóan, a felismerőhelyen belül hasítanak. Ezek az enzimek 4-8 bp méretű specifikus szekvenciákat ismernek fel (restrikciós helyek), amelyek palindromok: 5'-3' irányban mindkét szálon ugyanaz a bázisok sorrendje.

31 Restrikciós endonukleázok
A restrikciós enzimek egy része úgy vágja a DNS-t, hogy rövid, egyszálú, komplementer végek keletkeznek a hasítás helyen. Ezek a "ragadós" végek nagy szerepet játszanak a rekombináns DNS-technikákban, mert könnyen újra összetapadnak ugyanazon vagy más DNS-darabok ugyanolyan ragadós végeivel. A párosodott szekvenciák a DNS-ligáz nevű enzim segítségével stabilan összekötik a két DNS-fragmentet.

32 Restrikciós endonukleázok
A restrikciós enzimek másik csoportja a DNS-t a felismert szekvencia középpontjában vágja, így „tompa” végek keletkeznek, amelyek - miután hiányoznak az összekapcsolódást megkönnyítő túlnyúló komplementer szálak - igen nehezen tapadnak újra össze. Előnyük azonban, hogy ebben az esetben csak annyi szükséges az összekapcsolódáshoz, hogy mindkét vég „tompa” legyen.

33 Restrikciós endonukleázok
TOMPA VÉG RAGADÓS VÉG

34 Restrikciós (=fizikai térképek)
Def.: Olyan ábrázolásmód, amely megmutatja a különféle restrikciós enzimek hasítési helyei milyen sorrendben követik egymást a DNS mentén. Készítése során egy adott DNS-szakaszt különféle restrikciós enzimekkel emésztenek külön-külön és együtt is. Az emésztés során képződő fragmenteket elkülönítik, meghatározzák a fragmentek méretét. Méret alapján a fragmenteket sorrendbe rendezik térkép

35 Restrikciós (=fizikai térképek)
A restrikciós helyek helyzete, egymástól mért távolsága arányos az emésztés során képződő fragmentek hosszával, a DNS-t alkotó bp-ok hosszával. Nemcsak gének térképezését, hanem molekuláris klónozásukat is lehetővé teszik.

36 Southern blott Def.: Fragmentek detektálása jelzett DNS-próbával.
1) Nitrocellulóz (vagy nylon) filterre blottolják a gélelektroforézissel elkülönített fragmenteket. Blottolás= gélből a filterre szívják a DNS-fragmentet. 2) NaOH-kezelés 3) 10 min 90-95C0  denaturáció 4) Egyszálú DNS filterre kötése

37 Southern blott 5) 32P próbával (vagy fluoreszkáló molekulákkal) inkubálás (komplementer az egyszálú DNS-sel) 6) Mosás (nem hibridizált DNS eltávolítása) 7) Röntgenfilm készítése 32P elbomlikradioaktiv béta-sugárzás fekete ezüstszemcsékként látszik a filmen.

38 Northern blott RNS molekulák elkülönítése, izolálás, gélelektroforézis, nitrocellulóz szűrő, sütés. DNS próbával kimutathatóak azok, amelyek hibridizáltak a a DNS-próbával.

39 Western blott

40 Western blott Fehérjemolekulák elkülönítésére használatos technika,
elve ua., mint a Northern blottolásé, itt azonban specifikus ellenanyaggal kezelt DNS-próbával detektálják és teszik láthatóvá a keresett fehérjemolekulát.

41 FISH(fluoreszcens in situ hibridizáció)
Specifikus kromoszómális DNS-szakaszt láthatóvá tevő technika. A komplementer nukleinsav szekvenciák akkor is hibridizálnak egymással, ha az egyik DNS-fonal egy krsz része. A hibrid molekula FISH módszerrel láthatóvá tehető, és mikroszkópban tanulmányozható. A hibrid szakasz kimutatása különleges erősítést igényel, hogy tanulmányozható legyen.  immunglobulin-GFP  DIG

42 FISH DIG (=digoxigén): DNS próbát megjelöljük ezzel, a próbát a DIG-en keresztül egy elsődleges ellenanyag ismeri fel. Ez az ellenanyag a DIG-gel specifikusan reagál. Az elsődleges ellenanyag molekulái másodlagos ellenanyaggal kapcsolódnak, amelyek fluoreszcens anyaggal jelzettek.

43 FISH A próba-DNS sok DIG-et tartalmaz, és a DNS hibrid több elsődleges ellenanyaggal kapcsolódik, amely elsődleges ellenanyag több másodlagos ellenanyaggal kapcsolódik. A másodlagos ellenanyag sok floureszcens anyaggal van megjelölve  szendvics szerkezet: kellő intenzitással fluoreszkál, amely fluoreszcens mikroszkópban tanulmányozható.

44 FISH

45 FISH

46 VNTR Eukromatinban: a rövid DNS szekvenciák tandem módon ismétlődve vannak elrendeződve. VNTR: mérsékelten repetitív szekvencia osztályába tartozik. Ismétlődő szekvencia: = mikroszatellit vagy VNTR (variable number of tandem repeats) Az egyes kópiák száma a VNTR-blokkokban és az egyes emberekben is különbözőek Igazságügyi orvostanban személyes azonosítására használják.

47 VNTR

48 VNTR analízis

49 VNTR analízis 1) VNTR amplifikálása PCR módszerrel (apai és anyai eredetű krsz-ból származó DNS alapján). A PCR primerek azon DNS szekvenciáknak komplementerei, amelyek közvetlenül a VNTR szomszédságában vannak. A PCR termék hossza függ: a VNTR-ben ismétlődő „egység” hosszától a kópiák számától. 2) Gélelektroforézis Az „egység” DNS szakasz hosszának ismeretében és a PCR termék mérete lapján meghatározható a kópiák száma.  Adott emberre jellemző mintázat képződik. Érzékeny technika: egyetlen hajhagyma vagy vércsepp alapján elvégezhető a VNTR analízis.