Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ Készítette: Hajdu Csilla.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ Készítette: Hajdu Csilla."— Előadás másolata:

1 FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ Készítette: Hajdu Csilla

2 Módszer elve Fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próba a sejt morfológiájának változása nélkül bejut a sejtbe, ahol specifikusan köt a komplementer target szekvenciához

3 Alkalmazása Mikroorganizmusok gyors és pontos mennyiségi és minőségi meghatározásra alkalmas Mikroorganizmusok gyors és pontos mennyiségi és minőségi meghatározásra alkalmas Speciális gének expressziójára Speciális gének expressziójára Morfológiáról, szerkezetről,térbeli elhelyezkedésről ad információt Morfológiáról, szerkezetről,térbeli elhelyezkedésről ad információt

4 Alkalmazásának előnyei Látható, de nem tenyészthető mikroorganizmusok vizsgálata Látható, de nem tenyészthető mikroorganizmusok vizsgálata Lassan szaporodó, többihez képest metabolikus hátrányban lévő sejtek is detektálhatók, bár a fluoreszcencia intenzitása kisebb Lassan szaporodó, többihez képest metabolikus hátrányban lévő sejtek is detektálhatók, bár a fluoreszcencia intenzitása kisebb Különböző fluoreszcens festékkel egyszerre többféle mikróbaközösség vizsgálható Különböző fluoreszcens festékkel egyszerre többféle mikróbaközösség vizsgálható mRNS-ek hibridizálásával bizonyos enzimek termelését végző sejtek detektálhatók mRNS-ek hibridizálásával bizonyos enzimek termelését végző sejtek detektálhatók

5 Alkalmazásának hátrányai Lassú anyagcseréjű mikroorganizmusoknál kis intenzitású jelet kapunk Lassú anyagcseréjű mikroorganizmusoknál kis intenzitású jelet kapunk Élő és holt sejteket nem tudunk megkülönböztetni Élő és holt sejteket nem tudunk megkülönböztetni Mikroorganizmusok és a környezetük (pl.: talaj) autofluoreszceniiája gondot okoz  speciális szűrők Mikroorganizmusok és a környezetük (pl.: talaj) autofluoreszceniiája gondot okoz  speciális szűrők rRNS háromdimenziós struktúrája miatt a hozzáférés nem azonos valószínűségű rRNS háromdimenziós struktúrája miatt a hozzáférés nem azonos valószínűségű Festékek fakulása( csökkentése: fakulást gátló anyagok, fotostabil festék: cianin alapú, keskeny sávú filter) Festékek fakulása( csökkentése: fakulást gátló anyagok, fotostabil festék: cianin alapú, keskeny sávú filter)

6 Hibridizáció menete 1. A minta fixálása Sejt átjárhatóvá tétele Sejt átjárhatóvá tétele Sejt épségének fenntartása Sejt épségének fenntartása RNS-ek védelme RNS-ek védelme 2. Speciális mintaelőkészítés, tárgylemezhez rögzítés Sejtek bevonóanyaggal kezelt tárgylemezre cseppentés, majd dehidratáció (alkoholban 50, 80, 100%-os) Sejtek bevonóanyaggal kezelt tárgylemezre cseppentés, majd dehidratáció (alkoholban 50, 80, 100%-os)

7 Hibridizáció menete 3. Hibridizáció A fluoreszcens festékkel jelölt a komplementer próba mintához adása A fluoreszcens festékkel jelölt a komplementer próba mintához adása 4. A nem hibridizált próba eltávolítása mosással 48°C-os mosópufferrel, jéghideg csapvízzel mosás, majd szárítás 48°C-os mosópufferrel, jéghideg csapvízzel mosás, majd szárítás 5. A minták értékelése mikroszkóppal Keskeny sávú filterrel felszerelt hagyományos mikroszkóppal, kamerával a képek digitalizálása Keskeny sávú filterrel felszerelt hagyományos mikroszkóppal, kamerával a képek digitalizálása

8 Fluoreszcens festékek Fluoreszcein származékok (pl.: fluoreszcein izotiocianát) Fluoreszcein származékok (pl.: fluoreszcein izotiocianát) Rhodamin származékokj(pl.: tatrarhodamin izotiocianát) Rhodamin származékokj(pl.: tatrarhodamin izotiocianát) Cianin származékok: Cy3 – rRNS-hez kötődik, gerjesztés: 550 nm, emisszió: 570 nm Cianin származékok: Cy3 – rRNS-hez kötődik, gerjesztés: 550 nm, emisszió: 570 nm DAPI – DNS-hez kötődik, gerjesztés: 358 nm, emisszió: 461 nm DAPI – DNS-hez kötődik, gerjesztés: 358 nm, emisszió: 461 nm RNS-hez is kötődik: emisszió kb.: 400 nm

9 Hibridizált Escherichia coli

10

11 DAPI-val festett Trichosporon cutaneum

12 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Trichosporon cutaneum Saccharomyces cereviciae Bacillus subtilis

13 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Trichosporon cutaneum Bacillus subtilis

14 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Trichosporon cutaneum Saccharomyces cereviciae Bacillus subtilis

15 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Trichosporon cutaneum

16 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Trichosporon cutaneum Saccharomyces cereviciae

17 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni


Letölteni ppt "FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ Készítette: Hajdu Csilla."

Hasonló előadás


Google Hirdetések