Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Transzláció prokariótákban. A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek 30S30S * 30S * + mRNAPK k1k1 k -1 PK k2k2 k -2 IK TK k3k3 ( 30S + IF1, IF2,

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Transzláció prokariótákban. A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek 30S30S * 30S * + mRNAPK k1k1 k -1 PK k2k2 k -2 IK TK k3k3 ( 30S + IF1, IF2,"— Előadás másolata:

1 Transzláció prokariótákban

2 A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek 30S30S * 30S * + mRNAPK k1k1 k -1 PK k2k2 k -2 IK TK k3k3 ( 30S + IF1, IF2, IF3, fMet-tRNS Met ) ( preiniciációs komplex) ( iniciációs komplex) ( transzlációs komplex) K 1 nagy, ha az SD és a rRNS közti kölcsönhatás erős. k 2 a SD és a transzlációs start kodon közti távolság, és a régió másodlagos szerkezetének függvénye.

3 A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek technikai megközelítés

4 Shine - Dalgarno szekvencia GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS 3'végéhez, pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz operon) 10 x növekedés a termék mennyiségében a SD szekvencia hosszának növelése nem feltétlenül növeli a transzlációt Hasonlóan a promóterekhez, túl erős kötődés a SD szekvencia és a 16S rRNS 3’ vége között a transzlációt gátolhatja. Transzlációs start kodon kodon gyakoriság AUG91 % GUG8 % UUG1 %

5 Az AUG előtti szekvenciák 20x-os különbség UAU, CUU >> UUC, UCA, AGG ("-1 triplet) G-k kerülendők Az AUG utáni szekvenciák 30x -oskülönbségek lehetnek AAA(Lys) > AAG(Lys) > UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)... A természetes gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala) transzlációs szabályozás a 2. kodonnal +10 régió AT gazdag

6 Távolság a start kodon és a SD között - meglehetősen érzékeny, általban bázispár megengedett. - Génfüggő, egy gén esetén általában csak kicsit változhat. A köztes szekvencia összetétele “A” jó, ha van (2x-es stimulus),“C” mindegy “U” a "-4"-es pozícióban hatékony “G” gátol (3x-os gátlás) Upstream nemtranszlálódó szekvencia Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása megszünteti a transzlációt (ld lac). Minimum 10 bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötődnek hozzá.

7 Kodon felhasználási preferencia Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak, a különböző sejtféleségek különböző gyakorisággal használják az azonos aminosavakat kódoló tripleteket. Ha a termeltetendő fehérje génjének kodon használata nagyon eltér a gazdasejtétől, akkor meg kell szintetizáltatni a gént a gazda sejt preferenciájának megfelelően. Alternatív megoldás: a gazdasejt kodon preferenciájának megváltoztatása, ritka kodonokhoz tartozó tRNS gének bevitelével

8 [gbbct]: 50 CDS's (13879 codons) Sphingomonas paucimobilis AmAcid Codon Number /1000 Fraction Gly GGG Gly GGA Gly GGT Gly GGC Glu GAG Glu GAA Asp GAT Asp GAC Val GTG Val GTA Val GTT Val GTC Ala GCG Ala GCA Ala GCT Ala GCC Arg AGG Arg AGA Ser AGT Ser AGC Lys AAG Lys AAA Asn AAT Asn AAC Met ATG Ile ATA Ile ATT Ile ATC Thr ACG Thr ACA Thr ACT Thr A CC Trp TGG End TGA Cys TGT Cys TGC End TAG End TAA Tyr TAT Tyr TAC Leu TTG Leu TTA Phe TTT Phe TTC Ser TCG Kodon felhasználási preferencia – táblázat egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján a gén E. coli-ban, vagy élesztőben való expresszálhatósága in silico becsülhető.

9 STOP kodon UAA UGA UAG kötődő faktor RF1, RF2 RF1 RF2 UAA >> UGA, UAG Az esetek 80 %-ában: UAAU

10 KÉT CISZTRONOS EXPRESSZIÓS RENDSZER 1 Cisztronos rendszer ATGstruktúrgén 5’3’ SD mRNS 2 Cisztronos rendszer termeltetendő fehérje 2. STOP 1. STOP ATG1. cisztron 5’3’ 1. SD ATG2. cisztron 2. SDmRNS STOP Az 1. cisztron tetszőlegesen tervezhetú, de: - ne legyen túl hosszú, hogy ne terhelje feleslegesen a sejtet (felesleges műtermék) néhány aminosav - AT gazdag legyen a másodlagos struktúrák elkerülése végett.

11

12 1 Cisztronos rendszer ATGstruktúrgén 5’3’ SD mRNS 2 Cisztronos rendszer termeltetendő fehérje 2. STOP 1. STOP ATG1. cisztron 5’3’ 1. SD ATG2. cisztron 2. SDmRNS STOP Az 1. cisztron STOP kodon pozíciója a 2. cisztron Shine-Dalgarno szekvenciájához képest meghatározó a transzláció hatékonysága szempontjából. PÉLDA bGH (marha növekedési hormon) Egy cisztronos rendszerben < 0.4 % fehérje Két cisztronos rendszerben 1. cisztron...GGAGGAATAACATATG...2. cisztron. elrendeződésben 24 % fehérje termeltethető

13 Kifordított – antiriboszómális kötőhelyen alapuló - rendszer

14 PROTEOLÍZIS Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási mechanizmusa E. coli-ban Abnormális fehérjék, sejten belüli aggregátumok ATP függő endoproteázok polipeptidek < 1500 Da endoproteázok peptidek aminosavak oldékony mono-, di- és tripeptidázok

15 La (Lon) a fő ATP függő proteáz  87 kDa egységekből felépülő homotetramer,  ATP és Mg 2+ függő, az ATP-áz aktivitás nem a polipeptid kötés felbontásához, hanem a degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell,  in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez változhat, és ennél nagyobb.  hasonló fehérjék előfordulnak magasabbrendűekben is, pl. egy máj mitondriális proteáz immunológiailag keresztreaktív  abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl. szabályozó fehérjék bontása)  szerin proteáz, hidrofób jellegű szekvenciáknál hasít  alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje hozzákapcsolódása aktiválja,  a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez kapcsolódó szabályozás alatt áll:  32 faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke

16 inaktív proteáz (4 ADP) protein szubsztrát 4 ADP 4 ATP - Mg 2+ alloszterikus aktiválás aktív proteáz (4 ATP) 4 PO Mg 2+ Proteolitikus ciklus

17 Genetikai vonatkozások léteznek inszerciós, deléciós lon mutánsok A lon - mutáció másodlagos hatásai Poliszaharid burok képzés (főleg alacsonyabb hőmérsékleten, mint 34 o C) Megoldás: 37 o C-on növeszteni galE struktúrgének inaktiválása cps (capsule) struktúrgének inaktiválása rcsB, rcsA szabályozó régió mutánsok A lon mutánsok UV érzékenyek DNS sérülés  filamentáció Gazdag médiumon akár letális is lehet ok: SOS indukálható sejtosztódás inhibitor SulA. Megoldás: - ne használjunk yeast extraktot, hanem tryptont - sulA mutánsok

18 Ti (Clp) a másik ATP függő proteáz  81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekből álló heterodimer, ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa móltömegű  ATP és Mg 2+ faktorok szükségesek hidrofób részeknél hasít, de a specificitás eltér a La-tól  az alegységek külön multimerizálódnak  HtpR szabályozás alatt áll TulajdonságTi (Clp) proteázClpPClpA aktivitásfehérje degradáció ATP hidrolízis mellett peptidáz ATP független ATP-áz fehérje aktivált KofaktorMg 2+ - InhibítorMalNEt, iPr 2 P-FiPr 2 P-FMalNEt StabilizálásATP, glicerinhőstabilATP, glicerin natív méret700 kDa260 kDa160 kDa alegységek6 ClpA + 12 ClpP21 kDa81 kDa

19 Genetikai vonatkozások  Rendelkezésre állnak clp mutánsok  a mutáns egyedül nem, de a lon- nal együtt hatékony Egyéb proteázok  OmpT külső membránhoz kapcsolódó proteáz  DegP periplazmatikus proteáz  T4 fág fertőzés stabilizálja a fehérjéket  pin gén terméke: La inhibitor

20 E. coli törzsgenotípusKiindulási törzsMegjegyzés lon mutánsok SG1117  gal  lac lon-146::  Tn10 leu sup+ rec+ HB101Tetraciklin rezisztens, jól transzformálható SG12041  gal,  lon-510 sulA recAC600nincs filamentáció Rec- lon htpR mutánsok SG21163  lon-510 supFts htpRam165MC4100hőmérséklet érzékeny lon clp mutánsok SG12044  gal  lon-510 sulA clpA319::  kan C600kanamycin rezisztens lon clp htpR mutánsok SG21173  lon-510 supFts htpRam165  clpA319::  kan  lac MC4100kanamycin rezisztens, hőmérséklet érzékeny Példák proteázaikban mutáns E. coli törzsekre

21 FÚZIÓS FEHÉRJÉK A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a fúziós partnerek génjeit a megfelelő leolvasási keretben úgy klónozzuk össze, hogy az 5’ vég felőli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne szerepeljen. Így egy polipeptidláncot kapunk, amelyben a kiinduási fehérjék egymást követő régiókként helyezkednek el. ELŐNYEI 1. Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus stabilitást jelenthet 2.Óriási előny a tisztítás során, affinitás oszlopok 3.szignálpeptiddel való fúzió, szekretált fehérje (limitált) 4.Az in vitro hasítás sokszor pontosabb, intaktabb N-terminális szekvenciát eredményez

22 Oldhatatlan "iclusion bodies" trpEII, vagy cII, nincs proteolízis, differenciális centrifugálással az "inclusion body" könnyen tisztítható, probléma: nem aktív fehérje pl sometostatin, inzulin A, B, ellenanyag termelés Oldható forma biológiailag aktív fehérje, affinitás oszlopon való tisztítás problémák a stabilitással, kevésbé jósolható Fúziós fehérjék oldhatósága

23 Egyéb hasznosítási lehetőségek 1. a szignál peptidekkel való fúzió előnyei (ld. később) a periplazmában, illetve az extracelluláris térben oxidatívabb környezet, diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF, IGF A periplazmában az összfehérje 4%-a található, értelemszerűen kevesebb proteáz,könnyebb tisztítás 2.A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így a kívánt fehérje immobilizálható 3.funkcionális, struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai felhasználás alkalmasan választott fúziós partner esetén nincs szükség hasításra. 4.megfelelő hasítás után az intakt fehérje tetszőleges biokémiai, biofizikai vizsgálata

24 A fúziós fehérjék tisztításának elve I. 1. affinitás kromatográfia II. hasítás III. 2. affinitás kromatográfia tiszta fehérje fúziós partner célfehérje

25 A fúziós fehérjék típusai I. I. Szekréció SX T P Megjegyzés pl. humán növekedési hormon alkalikus foszfatáz szignál szekvenciával II. Polimerizáció XX T P fehérje-élettartam növekedés, pl. proinzulin 1-2 percről 60 perc, IGF 200x-os növekedés III. C-terminális fúzió AX T P a fúziós partner intakt szabályozó régiója használható, pontosabb proteolitikus hasítás IV. N-terminális fúzió XB T P amino terminális szekvenciák meghatározása, a proteolititkus hasítás csonkot hagyhat a “B” N-terminálisán

26 A fúziós fehérjék típusai II. V. A szekréció és a C-terminális fúzió kombinációja AXS T P a termék folyamatosan kinyerhető affinitáskromatográfiával VI. Kettős fúzió AXB T P AXB T P XAB T P nagy tisztaságú, nagy stabilitású termék, hátrány: két tisztítás, hasítás szükséges VII. Szekréció-inszerció XIS T P membrán fehérjék termeltetése a membránban

27 FehérjeSzármazási helymolekulasúly (kDa)szekrécióligand  -galaktozidázEscherichia coli116-TPEG, APTG Protein AStaphylococcus aureus31+IgG Zszintetikus7+IgG CATEscherichia coli24+klóramfenikol sztreptavidinStreptomyces13+biotin PhoSEscherichia coli36+hidroxilapatit Protein GStreptococci28+albumin MBPEscherichia coli40+keményítô GSTEscherichia coli26-glutation poliargininszintetikus1-3-ioncsere poliglutamátszintetikus1-2-ioncsere polihisztidinszintetikus1-7+Ni 2+, Zn 2+, Cu 2+ Fúziós partnerfehérjék CAT: klóramfenikol-acetiltranszferáz; Z: A Protein A fehérje IgG kötô doménje; PhoS: foszfát kötô fehérje; MBP: maltóz-kötô fehérje; GST: glutation S-transzferáz; TPEG: p-aminofenil--d-tiogalaktozidáz; APTG: p-aminofenil--d-tiogalaktozid.

28 FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI I. KÉMIAI hasító ágenshasítási hely brómcián- Met  hangyasav- Asp  Pro - hidroxilamin- Asn  Gly - ENZIMATIKUS aminopeptidázok aminosavat hasítanak az N-terminálisról karboxipeptidázok aminosavat hasítanak a C-terminálisról

29 FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI II. Endopeptidázok ENZIMATIKUS ENZIMHASÍTÁSI HELY kollagenáz- Pro - Val  Gly - Pro - enterokináz- Asp - Asp - Asp - Lys  Xa faktor- Ile - Glu - Gly - Arg  trombin- Gly - Pro - Arg  tripszin- Arg, Lys  klosztripain- Arg  Ala 64 -szubtilizin- Gly - Ala - His - Arg 

30 Nómenklatúra: szekréció: az extracelluláris térbe export: az sejtmembránokba vagy a periplazmatikus térbe A fehérje szekréció Előnyei  A tisztítás sokkal egyszerűbb, esetleg folyamatos üzemű lehet  Az periplazma illetve az extracelluláris tér sokkal oxidatívabb, korrektebb protein folding  A fehérje degradáció sokkal csekélyebb mértékű, proteolitikusan stabilabb termékek

31 Baktériumok membránszerkezete

32 SZEKRÉCIÓ E. coli-ban  nem hatékony vagy nem teljes transzport a membránon keresztül  alacsony transzport-kapacitás, stresszválasz, idő előtti fehérjedegradáció  ha a transzporthoz a fehérje poszttranszlációs módosítása szükséges, akkor ennek hiánya kis molekulákra, mint növekedési faktorok vannak jó eredmények nagy molekulák esetén problémák lehetnek, pl az ER hiánya (módosítások színhelye) vannak fehérjék, amelyek nem szekretálhatóak, esetleg letális, pl -galaktozidáz fúziós fehérjék exportja

33 Fő protein transzport mechanizmusok bacteriumokban Sec útvonal: egyszerű kofaktor mentes polipeptidekre Tat útvonal: több alegységes enzimekre, amelyek kofaktorokat is tartalmaz(hat)nak transzport: a fehérje összeszerelődése után SRP, signal recognition particle, és receptora E. coli homológ: Ffh forty five homolog, FtsY Poszttranszlációs transzport Kotranszlációs transzport

34 - szignál szekvencia, - szignál peptidázok, szignál peptidázI (lep), Ala-X-Ala felismerőhely - szignál peptidázII (lsp), szignál szekvenciák eltávolítása lipoproteinekrôl - sec A, B, D, E, Y gének mutációja a prekurzorok felhalmozódásához vezet, Némi átfedés van közöttük. -Régebben prl nómenklatúra is volt -SecA, 102 kDa, citoplazmatikus, és belső membránkötött, ATP-áz aktivitás, kölcsönhatás a szállítandó fehérjével -SecB szekréció kompetens konformációért felelős -SecYEFG a csatorna kialakításáért felelős -SecD a periplazmatikus térbe való “leválásért” Sec útvonal E. coli-ban

35 SZIGNÁL SZEKVENCIÁK GRAM - BAKTÉRIUMOKBAN I. Standard szignál peptid COOH “N”“H”“C”  1 K vagy R hidrofób  hélix, sok A és L, nem lehet P, K, R, D, E, H, R fordulat P G hasítóhely AGSAGS AXAX semleges vagy negatív fMG fordulat AVSAVS -3 Lipoprotein szignál peptid “C” COOH “N”“H”  1 K vagy R hidrofób  hélix, sok A és L, nem lehet P, K, R, D, E, H, R hasítóhely AGAG D lipoprotein kiválasztó szignál semleges vagy negatív fM L

36 Gram-pozítív baktériumok  a szignál peptid szignifikánsan hosszabb  kiterjedtebb “H” régió  a “H” régióban a Leu dominál  nem olyan szigorú a (-1, -3) szabály  a hasítóhely után nincs kitüntetett aminosav SZIGNÁL SZEKVENCIÁK II. Eukarióták az eukarióta szekretált fehérjéket az E. coli export mechanizmusa felismer(het)i, illetve fordítva

37 A Sec függő fehérje transzlokáció modellje E. coli-ban ATP ADP+P i SPáz YE G A B YE G A AT P ADP+P i YE G A D H+H+ H+H+ periplazma citoplazma INICIÁCIÓTRANSZLOKÁCIÓKISZABADULÁS N+N+ C+C+ CN citoplazma Átjutás a C-terminális véggel, ez az áltatános Átjutás az N-terminális véggel, inszerció

38 A Sec útvonal - másképpen

39

40 A prokarióta és eukarióta transzportmechanizmusok összehasonlítása

41 Az SRP (Ffh-FtsY) útvonal A Sec és az SRP közötti választás: “trigger” faktor membrán fehérjékre jellemző

42 Twin-arginine szignál peptid n-régióc-régióh-régió N + moderáltan hidrofób S/T-R-R-x-F-L-K n-regionc-region Sec szignál peptid h-region N erősen hidrofób + Signal sequences for targeting SRP: erősen hidrofób szignál, nem hasad le

43 A periplazmitikus hidrogenázok bioszintézise citoplazmatikus összeszerelődési modell Periplazma Citoplazma csatorna Holoenzim kofaktor(ok) prekurzor szignál peptid

44 citoplazma membrán periplazma N N N N C C C C TatA TatE TatB TatC The twin-arginine translocase (Tat) proteins

45 citoplazma TatC TatB TatA membrán aktív formát felvett enzim A TAT modell


Letölteni ppt "Transzláció prokariótákban. A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek 30S30S * 30S * + mRNAPK k1k1 k -1 PK k2k2 k -2 IK TK k3k3 ( 30S + IF1, IF2,"

Hasonló előadás


Google Hirdetések