Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

MTA SZBK DNS-Chip Laboratórium www.szbk.hu/chiplab~ DNA-chip Lab.BRC, Szeged A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika 2003.10.09.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "MTA SZBK DNS-Chip Laboratórium www.szbk.hu/chiplab~ DNA-chip Lab.BRC, Szeged A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika 2003.10.09."— Előadás másolata:

1 MTA SZBK DNS-Chip Laboratórium DNA-chip Lab.BRC, Szeged A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika

2 Kromoszómák genetikai állomány hordozói DNS mRNS Fehérjék sejtfunkciók ellátása Gének információ hordozók sejt AAAAAA

3 „Genom, avagy a DNS birodalma”: egy szervezet teljes DNS készlete. „Transzkriptom, avagy a hírvivő RNS-ek birodalma”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő mRNS készlet. „Proteom, avagy a fehérje birodalom”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő fehérje készlet. Néhány definíció DNA-chip Lab.BRC, Szeged cDNS=copy DNS, az érett mRNS DNS-sé átírt változata Oligonukleotid=néhány tíz nukleotidból álló DNS darab

4 A genomprogram Humán Genom Projekt és a Celera Genomics nevű biotechnológiai óriás 2000-ben együttesen jelentették be az emberi genetikai állomány kódjának közel teljes megfejtését februárjának közepén hozta nyilvánosságra eddigi eredményeit a világ két legrangosabb tudományos folyóiratában, a Nature, illetve a Science lapjain. „Az emberiség 100,000 éves történelmének egyik legfontosabb napja, hiszen az emberek először olvashatják el saját könyvük betűit” Craig Venter, a Celera igazgatója DNA-chip Lab.BRC, Szeged

5 Trillió sejt/szervezet 3 milliárd betű/sejt 2 méternyi DNS/sejt 1betű/mp, 24 óra/nap 100év. 1betű-mp, 16,5perc egy különbség nukleotidot határoztak meg minden mp-ben Human Genome Project keretén belül 3 mm-es távolságban összerakva 9000 km lenne, több mint 2x hosszabb mint a Mississippi a korábbi feltételezésekkel ( ezer gén) ellentétben csak kb. 35ezer gén a genomnak csak 1-1,5%-a kódoló, azaz exon szekvencia egyenlőtlen géneloszlás-genetikai sivatagok egyenlőtlen a kromoszómális eloszlás is (az XY kromoszómák sokkal kevesebb gén tartalmaznak mint pl. a 17 vagy 22-es kromoszóma kb. 3millio SNP minden 1000 „beteg” a rasszok jobban hasonlítanak egymásra a két nem Néhány érdekes adat az emberi genomról DNA-chip Lab.BRC, Szeged

6 Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések daganat képződés, gyulladás, különböző betegségek sejtosztódás, diffrenciáció, sejthalál A funkcionális molekuláris biológia lényege 1. funkciók felderítése G T P G T P Minőségi és mennyiségi változások szövet, szerv szint sejt szint

7 DNA-chip Lab.BRC, Szeged DNS RNS fehérje metabolitok vizsgálata Összehasonlítás egészséges szövettel Segítség:adatbankok,szekvenálásiprojektek A funkcionális molekuláris biológia és diagnosztika lényege (2) Eltérő állapotok molekuláris hátterének felderítése Trombosis, sclerosis

8 Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések A funkcionális molekuláris biológia lényege 3. G T P G P Minőségi és mennyiségi változások követése aktív gének vizsgálata AAAAA T P P P P P

9 A biochipek nagyszámú gén vagy fehérje együttes funkció analízisére alkalmasak A biochipek nagyszámú (több ezer) cDNS, oligonukleotid vagy fehérjemolekula részletet tartalmazó kémiailag aktivált tárgylemezek Az 1990-es években egy forradalmian új technika, fejlődött ki a gén és fehérje funkciók analízisére. DNA-chip Lab.BRC, Szeged Chip-technológia

10 A DNS-chip technolólgia komplementer nukleinsav-láncok hibridizációján alapul

11 Comparative molecular expression analysis A. Examination of “transcriptome” B. Examination of “proteome” (generation of mRNA maps) (generation of protein maps) - 2D gelelectrophoresis - MALDI-TOF mass spectrometry - combined electrophoretic and microsequencing techniques - “protein-chip” techniques 3. Sequence-based techniques - ESTs (expressed sequence tags) - SAGE (serial analysis of gene expression) - DNA sequencing chip - Mass spectrometry sequencing - Differential display - RDA (representational difference analysis) 2. PCR-based techniques - Northern blotting - RNase protection/S1-mapping - Subtraction cloning - DNA arrays 1. Hybridization-based techniques DNA-chip Laboratory, BRC. Szeged

12 Dot-blot technika Radioaktív génspecifikus próba Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra kötve Hibridizáció A pozitív RNS minták jelölődnek Reverz dot-blot technika Génspecifikus minták rögzítése szilárd hordozóhoz Teljes RNS jelölése Hibridizáció Pozitív génspecifikus minták jelölődnek DNS-chip technika ,000 Génspecifikus minta Hibridizálás DNA-chip Lab.BRC, Szeged

13 macroarray nylon membránon néhány 100 génspecifikus minta (DNS darab) radioaktív jelölés kis minta sűrűség ( pont/cm 2 ) microarray üveglemezen több génspecifikus minta (DNS darab) fluoreszcens jelölés közepes mintasűrűség (5000 pont/cm 2 ) chip üveglemezen több génspecifikus minta (DNS darab) fluoreszcens jelölés nagy minta sűrűség (10.000pont/cm 2 ) A chipek hordozó szerinti osztályozása

14 cDNS klón és/vagy DNS szekvencia biológiai minta szövetből, sejtkultúrából Makroarray Mikroarray Chip nyomtatás mRNS, DNS, fehérje adatfeldolgozás, bioinformatika, génműködésre vonatkozó információk értékelése Egy chipkísérlet lépései Hibridizálás, fehérje-ellenanyag kölcsönhatás néhány 100, vagy több 1.000, gén, fehérje jelölt minta X

15 cDNS alapú chip készítése Egyedi baktérium klónok izolálása izolálása kék/fehér szelekció PCR amplifikáció 96 mintahelyes lemezeken cDNS könyvtár baktériumban PCR reakció ellenőrzése Tisztítás felcsepegtetés üveglemezekre Minden lemezen több 1000 ismert és ismeretlen szekvenciájú cDNS darab szerepel duplikátumban Ismert és ismeretlen szekvenciájú cDNS darabokat tartalmazó klónok CHIPKÉSZÍTÉS DNA-chip Lab.BRC, Szeged

16 Microgrid ArrayerBioRobotics, UK DNA-chip Lab.BRC, Szeged

17 Microgrid Arrayer BioRobotics, UK 4, 16 tű4, 16 tű 84 lemez84 lemez 24 mikrotiter lemez (384)24 mikrotiter lemez (384) Sebesség: 6400 pont < 4h.Sebesség: 6400 pont < 4h. Sűrűség: pont/lemezSűrűség: pont/lemez DNA-chip Lab.BRC, Szeged

18 Nyomtatótű a MicroArrayer robothoz DNA-chip Lab.BRC, Szeged

19 Touch surface Move pinsWash, repeat Making microarrays by mechanical microspotting and ink jetting 1. Mechanical microspotting Sample is loaded into a spotting pin by capillary action Small volume is transferred to a solid surface by physical contact between the pin and the solid surface Same sample can be transferred with the same pin to the next solid surface generating multiple arrays Microarray After the first spotting cycle, the pin is washed and the next sample is loaded and deposited Microarray Wash, repeatDeliver drop Move jets Sample is loaded into a miniature nozzle equipped with a piezoelectric fitting An electrical current is used to expel a precise amount of liquid from the jet onto the surface Second sample is loaded and deposited to an adjacent address 2. Ink jetting DNA-chip Lab.BRC, Szeged

20 Oligonukleotid alapú chip készítése 1. szintetikus oligonukleotidok kémiai kikötése

21 Oligonukleotid alapú chip készítése 2. in situ szintézis CHIPKÉSZÍTÉS DNA-chip Lab.BRC, Szeged Affymetrix

22 Semi conductor Microarrays Multiplex in situ custom DNA synthesis 1k and 10k features available 1. Semiconductor Base 2. Scalable Density 3. Active Device - Computer Controlled Electro-Chemistry

23 In situ MicroArray DNA Synthesis Cycles

24 In situ MicroArray DNA Synthesis Cycles

25 Scalable Technology Platform 1K 1024 Features 10K 13,416 Features

26 Nagyobb DNS molekulák pl. PCR- felskszorozott cDNS klónok kovalens kikötése aktivált tárgylemezre DNA-chip Lab.BRC, Szeged

27

28 Fehérje-chipek DNS-chipek Mutációk, Egy nukleotid eltérések (SNP), deléció, inszerció Genom G Fehérjék Kifejeződés, módosítások, kölcsönhatások Proteom P Gén kifejeződés megváltozása Transzkriptom T mRNS AAAAA Mire alkalmasak a chipek? DNA-chip Lab.BRC, Szeged

29 Pontmutációk (SNP) detektálása Oligonukleotid alapú chipek egy nukleotid eltérés azonosítása DNS Jelölt DNS hibridizáció mosás detektálás Adat analízis 1. SNP: 3. pozíció A-C 2. SNP: 2. pozíció C-T DNA-chip Lab.BRC, Szeged 1. SNP 3 pozíció AGTCAGTC 2. SNP 2 pozíció AGTCAGTC

30 Génkifejeződés tanulmányozása mRNS Jelölt cDNS hibridizáció mosás detektálás Adat analízis: relatív aktivitás mérése a színessel jelölt gének aktívak a feketék nem DNA-chip Lab.BRC, Szeged aktív gének vizsgálata AAAAA – cDNS vagy oligonukleotid chip – transzkriptom analízise – aktív-inaktív gének detektálása – bonyolult adat és statisztikai analízis biológiai anyag

31 jelölt cDNS Cy5 dCTP Cy3 dCTP Hibridizáció, mosás Szkennelés DNA-chip Lab.BRC, Szeged Jelölt próba készítése: két különböző minta együttes analízise beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet RNS tisztítás cDNS írás RNS-ből (reverz transzkripció)

32 cDNS-chipek alkalmazásai: (1) szövetspecifikus génexpresszió különbségek vizsgálata RNS cDNS cDNS-chip 4000 különböző Arabidopsis génmintát tartalmaz DNA-chip Lab.BRC, Szeged

33 Gyógyszer-indukált génexpresszióváltozás vizsgálata Mycobacterium tuberculosis-ban cDNS-chip technikával 3,834 ORF (össz. becsült ORF 97%-a) PCR génspecifikus primerekkel, tisztítás és felvitel poli-L-lizinnel bevont mikroszkóplemezekre robot segítségével 1. cDNS-chip készítése PNAS (1999) 96, Adatfeldolgozás 3. Hibridizáció EREDMÉNYEK: - Isoniazid több olyan gént indukált, melyek a gyógyszerhatás mechanizmusával kapcsolatos fehérjéket kódolnak: II-es típusú zsírsavszintetázt, trehalóz dimikolil transzferázt. - további indukált gének: valószínűleg a gyógyszer toxikus hatásával magyarázható általános hatás miatt - egy új efflux proteint kódoló gén indukcióját is megfigyelték Az eredmények olyan információkat szolgáltathatnak, melyek gyógyszer hatásmechanizmusokat, új targeteket tárhatnak fel. 2. RNS izolálás, és próbakészítés M. tuberculosis-ból RNS izoláció, jelölt cDNS készítése Cy3-dUTP és Cy5-dUTP felhasználásával Reverz transzkripció reakcióban. Kezeletlen, kontroll baktériumok Isoniaziddal kezelt baktériumok

34 Új gének azonosítása Génfunkciók jellemzése Génkölcsönhatások megértése Differenciáció tanulmányozása Tumorképződés vizsgálata Gyógyszerek felfedezése RNS cDNS cDNS-chip 6000 különböző egyedi egér génmintát tartalmaz DNA-chip Lab.BRC, Szeged cDNS-chipek alkalmazásai: cDNS-chipek alkalmazásai: (2) eltérő állapotokért felelős génexpresszió különbségek vizsgálata

35 Egészséges és dagantos (HBL100 vs. breast carcinoma BT474) szövetek génkifejeződéseinek összehasonlítása DNA-chip Lab.BRC, Szeged

36 Genomszintű változások, kromoszóma rendellenességek, amplifikációk, deléciók detektálása DNS PCR Paraffinba ágyazott minták normál daganat Génátrendeződési arányok p p13-p21 01 p p p q21 01 q q q q24-q2501 q31-q32 02 p13-p12 02 q13 02 q34-q35 03 p p q 03 q21.1-q p p p q27 07 p15.3-7p14 07 p p23 08 q21.2-q p p13 09 q q32-q p q23 12 p13 12 q 13 q q24-q31 16 q p13 18 p11.1-q q p q q q q q q q13.1 Xp11.3-p11.23 Tüdő génarány agy génarány Metasztázisok, tumorok, multiplex tumorok jellemzése, igazolása

37 Lézer szkenner Cy5 Lézer szkenner Cy3 kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet Cy5 dCTP beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet jelölt cDNS Cy3 dCTP Képanalízis

38 ADATFELDOLGOZÁS ? Nem szignifikáns adatok „Árnyékzóna”

39 DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged Cy-3, Cy-5 jelek kvantitatív összehasonlítása Quantarray szoftverrel (GSI Lumonics) Arány és intenzitás megszorítások nélkül Arány és intenzitás megszorításokkal

40 DNS-chipek képanalízise

41 R1=(CH1I-CH1Bk)/(CH2I-CH2Bk) R1M=IF(CHB1<0.55,"",IF(CHB2<0.55,"",IF(FLAG=1,"",R1))) R1MN=IF(R1M="","",R1M/NoF) R1MNA=IF(R1MN="","",IF(R1MNx="","",IF(RMN1Rep>=RMN1x, IF(RMN1Rep/RMN1x<2,(RMN1x+RMN1x)/2,""),IF(RMN1x/RMN1Rep<2, (RMN1Rep+RMN1x)/2,"")))) Adatfeldolgozás, statisztikai analízis

42 Slide 42

43 Spot label Ratio Cy5/Cy3 Ábrázolási módszerek 1. normál arány

44 Ábrázolási módszerek 2. log2 arány

45 Leukémiák molekuláris osztályozása osztályozása génexpresszió monitorozással génexpresszió monitorozással DNS-chipek alkalmazásával DNS-chipek alkalmazásával - Új alosztályok felfedezése - Új esetek osztályozása - Jóslat kemoterápiás kezelés hatékonyságára - Atipikus esetek tisztázása Jövő: Jövő: - Tumorminták gyűjtése - Kemoterápia jellemzése - Expressziós analízis - Adatbank létrehozása - Alosztályok meghatározása - Kemoterápiára adott válaszok jellemzése DNS-chipekkel - hatásmechanizmus feltárása - rezisztenciáért felelős gének azonosítása Science 1999, 286, 531.

46 B-sejt limfómák osztályozása Alizadeh et al., Nature, 2000, 403,

47 Mintaelőkészítés, csoportosítások terve krónikus mieloid leukémiák osztályozásához Teszt és általános gének azonosítása: CML 1. beteg 2. beteg x. beteg RNS cDNS hibridizálás Későbbi kimenetel 1. típus 2. típus 3. típus diagnóziskezeléskorai reakció RNS kontrol RNS kontrol RNS kontrol relapszus tünetmentesség RNS kontrol RNS kontrol RNS kontrol RNS kontrol RNS kontrol RNS kontrol RNS kontrol

48 Génexpressziós klaszterek patkány fejlődése során a. Normalized gene-expression trajectories are shown grouped by waves that are determined by clustering. The graphs below show the average normalized expression pattern or wave over the nine time points for all of the genes in each cluster. b. Tree of all gene-expression pattern. c. Plots of all normalized time series, highlighted wave 3. The time of birth is marked by a vertical line DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

49 Dataprocessing and visualization Repression of cell division Imaging: „tree” & „galaxis” clastering methods Sejtosztódást gátló, apoptózist serkentő vegyület hatásának vizsgálata 3 sejttenyészeten 2 különböző koncentrációban humán cDNS-chippel


Letölteni ppt "MTA SZBK DNS-Chip Laboratórium www.szbk.hu/chiplab~ DNA-chip Lab.BRC, Szeged A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika 2003.10.09."

Hasonló előadás


Google Hirdetések