Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon

Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Adjunct Professor of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai.

Hasonló előadás


Az előadások a következő témára: "Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Adjunct Professor of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai."— Előadás másolata:

1 Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Adjunct Professor of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai Kutatócsoport, SzBK Csoportvezető, tudományos főmunkatárs vagy

2 Bioinformatika úgy általában adatbázisok felépítése ezen adathalmazok statisztikai analízise, matematikai értelmezése szabályszerűségek meghatározása szabályok hasznosítása – predikciók pl. funkcióra, rokonságra, eredetre, szerkezetre stb.

3 Bioinformatika úgy általában „ összehordott” adatokból építkezünk többnyire elmélet eleinte a gyakorlati hasznosítás majd a végén jön persze ez visszahat az elméletre

4 Mit lehet kiaknázni? genomiális adatbázisok fehérje szekvencia adatbázisok fehérje 3D szerkezeti adatbázisok stb, stb Meghatározó faktor: Mennyire megbízhatóak az adatok?

5 Proteomika A sejt fehérjetartalmának kvalitatív és kvantitatív jellemzése Mi van jelen? Mennyi? Milyen formában? Lokalizáció? Kölcsönhatások? Partnerek?

6 A proteomika különleges jellege nagyon is gyakorlati tudomány adatokat produkálunk, amit informatika segítségével adatbázisokból értelmezünk bővítjük/építjük az adatbázisokat, ill. új adatbázisokat hozunk létre új bioinformatikai eszközöket fejlesztünk ki az eredmények alapján

7 Problémák állandó dinamikus változások hatalmas mennyiségi különbségek igen eltérő fizikai tulajdonságok/ vagy csak árnyalatnyi különbségek – ugyanannak a génnek a termékeire

8 Még mindig „problémák” Poszt-transzlációs módosítások Idő-, faj-, állapot-, lokalizáció- stb. - függő permanens vs. dinamikus teljes vs. részleges jelentős vs. csekély méretváltozás hidrofil hidrofób Nem árt érteni a biológiához!

9 Láthatóvá tenni a komplexitást... Frakcionálni kell ! 1D-, 2D-, multidimenziós módszerek

10 Mi mindent kell meggondolni? Mennyire univerzális a módszer? Felbontása? Dinamikus tartománya? Követhetősége? Reprodukálhatósága? Kvantitatív-e?

11 1D-SDS-PAGE * Minden belemegy a gélbe, de kicsi a felbontás. * Várhatóan fehérje-elegyeket kell analizálni.

12 2D-elfo 1. dimenzió: izoelektromos fókuszálás → pI szerint - pH 3-10 DE savas vagy bázikus fehérjék NEM fókuszálódnak membrán-fehérjék kicsapódnak – ionos detergens nem használható 2. dimenzió: SDS-PAGE

13 1. spot 7. spot 8. spot 2. spot 3. spot 4. spot 5. spot 6. spot 9. spot pH: proteins 3 proteins 2 proteins 1 protein 4 proteins 1 protein 3 proteins Több példányban elkészítendő, statisztikai analízisre alkalmatos

14 2D-elfo másképpen 1. dimenzió: 16 BAC-PAGE (pozitív „fejű” detergens) 2. dimenzió: SDS-PAGE Minden belemegy a gélbe, de átlósan frakcionálódik – kis felbontás

15 Speciális 2D elválasztás 16-BAC SDSSDS Pros3510/14 (71%)33% Pros  734/36 (94%)63% Pros  612/12 (100%)42% Pros28.114/21 (66%)54% Pros2919/23 (83%)59% Pros  213/15 (86%)42% GC /14 (93%)35% ProsMA522/44 (50%)56% Pros2512/15 (80%)50% Pros  318/24 (75%)53% Pros266/15 (40%)46% Pros  511/12 (92%)26% GC /23 (47%)46% l(2) /19 (79%)72%

16 Festés Commassie Brillian Blue – kvanti Ezüst – érzékenyebb, de NEM kvanti Trükkök: funkciós csoportra specifikus festés differenciál festés

17 2D-kromatográfia 1. dimenzió: kation - ioncsere 2. dimenzió: fordított fázisú HPLC Követés: 215 nm-en → peptidkötés Nyilván semmi hidrofób nem érvényesül ilyen körülmények között... Reprodukálhatóság degradálódik az oszlop életkorával!

18 Ki is kell találni mit is válogattunk szét! Edman szekvenálás → N-terminuson blokkolt fehérjékkel, keverékkel nem megy Western-blot → tudni kell, hogy mit keresünk, és kell jó ellenanyag

19 alapötlet Egy bizonyos fehérje adott specificitású enzimmel emésztve szekvenciájára jellemző hasítási termékeket fog produkálni Ha a valóságos emésztményt az adatbázis „in- silico” eredményeivel összevetjük azonosítani tudjuk a fehérjét Az összehasonlítás alapja csak valami biztosan megjósolható és egyértelműen meghatároztató tulajdonság lehet: TÖMEG

20 A tömegspektrometria előnyei alkalmazható keverékekre blokkolt fehérjékre is kovalens módosítások azonosíthatóak

21 Detektálási érzékenység Edman szekvenálás – kb. 1 pmól M MS – kb fmól - 5x M Western blot – kevesebb, mint M

22 MS-alapú Proteomika Fordított bioinformatika: mérési adatok + adatbázisok + algoritmusok → biológiai eredmények Tudni illik valamit az analitikai módszerről

23 Mass Spectrometry 101 Ionokat mérünk Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Electrospray Ionization – többszörösen töltött ionok Nagy vákuumban quadrupole, Time-of-Flight, ioncsapda MS → MH + adatok MS-MS alias CID, CAD, PSD... → szekvencia info

24 Monoizotópos tömeg csak C 12, H 1, N 14, O 16 and S 32 ← 1 C 13 2 C 13

25 Felbontás: m/  m = /0.2 ~ 8000

26 Miért is kell felbontás?

27 Normál peptid, 1000-es felbontás

28 Normál peptid, es felbontás

29 Br-Trp-tartalmú peptid, 1000-es felbontás

30 Br-Trp-tartalmú peptid, es felbontás

31 3+ töltésű peptid, kis felbontás

32 3+ töltésű peptid, nagy felbontás Δ = = kb. 1/

33 Tömegmérés pontossága 0.1 Da mérési hiba egész jó 2 kDa-nál, DE katasztrófális egy kis molekulánál Relatív értéket adjunk meg! pars per million

34 Milyen pontosan tudunk mérni? belső standarddal 20 ppm-en belül ± külső standarddal 200 ppm-en belül ± intakt fehérjékre 0.1%-on belül ± Gyenge jeleknél nem érvényesül a Gauss eloszlás!

35 Emésztési elegy MALDI-spektruma

36 Peptidek ESIMS analízise

37 Intakt fehérjék MALDI-analízise

38 Intakt fehérje ESI-analízise

39 Ha ez így megy, minek egyáltalán emésztgetni? Miért nem mérjük az intakt fehérjéket? preparatív és interpretív akadályok

40 Minta-előkészítés Legyen a fehérje hozzáférhető a hasításra: → denaturálás → diszulfid-hidak bontása Emésztés, kémiai hasítás

41 Specifikus hasítások tripszin - Lys ↓ Arg ↓ endoproteáz Lys-C - Lys ↓ endoproteáz Glu-C - Glu ↓ (Asp ↓ ) endoproteáz Asp-N - ↓ Asp ( ↓ Glu) pH kb CNBr (+75 %-os TFA) - Met ↓

42 Egy nagyon praktikus software Segít pl. mólsúly –számításban, „megjósolja” a hasítási vagy MS-MS termékeket... „mindentudó”adatbázis-lekereső

43

44

45

46

47 Az analízis Egyben mérjünk vagy frakcionáljunk? MALDI vs ESIMS LC-MALDI LC-ESIMS

48 Mennyire kellene pontosan mérni a peptideket ? MH + = ± 0.3 ppm 9 különböző aminosav-összetétel különböző szekvencia 3 különböző elemi összetétel Ile/Leu ThrVal/SerLeu GlyGlu/AlaAsp

49 Miért kell még szekvencia info? Keverékek Kovalens módosítások Izoformák Splice variants És ha nincs bent az adatbázisban?

50 Hogyan tegyünk szert a szükséges információra? Feladat: → meghatározni a komponensek tömegét → egyet fizikailag elkülöníteni → „szétverni” Műszeres megoldás: tandem tömegspektrometria, ionkapu, ioncsapda Fragmentálás: post-source decay (PSD), ütközéses aktiválás (CID/CAD), elektron- befogás (ECD)

51 Peptid fragmentáció NH 2 -CH(R 1 )-CO-NH-CH(R 2 )-CO~ ~CO-NH-CH(R n )-COOH y n-1 y1y1 y n-2 b n-1 b2b2 (72) Ala-Ser-Pro-Asp-Tyr-Arg b i =  gyöksúly + 1 y i =  gyöksúly + 19 A fragmentáció módszer- és készülék- függő!

52 60.04S130.09y 1 -NH y2y b 3 +H 2 O528.25b 4 +H 2 O 70.07R138.07H277.14HR-NH HRE-NH y 4 -NH K147.11y1y RE415.23y 3 -NH m3m R197.10a2a HR423.21HRE569.32y4y R207.09b 2 -H 2 O336.18a 3 -NH y3y m2m K225.10b2b a3a a 4 -NH m4m E258.16RE b 3 -H 2 O482.25a4a m5m H259.13y 2 -NH b 3 -NH b 4 -H 2 O625.33m1m R266.17HR b3b b 4 -NH K269.12RE-NH HRE b4b4 SHREK - Elméleti MALDI-CID spektrum – MS product

53 z1z c2c a3a z3z c4c a2a z2z c3c a4a z4z4 SHREK – elméleti ECD fragmensek Elméleti „spektrum”: → lehetséges fragmensek, egyenlő intenzitással

54 És egy valóságos spektrum

55 A proteomika „Achilles sarka”? Elméleti azaz megjósolt „adatokon” alapuló azonosítás

56 bioinformatika = bio + informatika Nem szabad elfelejtenünk, hogy biológiai mintákkal dolgozunk! és kémiailag is aktív vegyületekkel! Az algoritmus lehet tökéletes, csak a biológiai rendszer nem viselkedik!

57 Megtörtént a frakcionálás, az emésztés...Jön az analízis! Mondjuk, MALDI MS-mérés frakcionálatlan, vagy HPLC után → egy jellemző (?) MH + sorozat ↓ MS-Fit Peptide Mass Fingerprint – alapú fehérjeazonosítás Mi lehet a baj? → aspecifikus hasítás, kovalens módosítás, szennyezés stb.

58

59

60

61

62

63 Nem mindig ilyen szép a menyasszony! azaz a PMF-alapú azonosítást meg kell erősíteni MIÉRT??? – lásd előbb és később is... a „vád tanúja”: az MS-MS kísérlet eredménye

64 MS-MS eredményekkel is lehet keresgélni!

65 Független PMF és MS-MS azonosítás az igazi!

66 Elegánsabb az on-line LCMSMS A nanoHPLC oszlopról minden megy a tömegspektrométerbe (250 nL/min) ún. „adatfüggő” adatgyűjtés 1)MS mérés 2)Komputer kiválasztja a legintenzívebb iont 3)MS-MS mérés

67 MS + MS-MS combined total ion current MS MS-MS

68 Lekeresés csak MS-MS adatokkal „script” – az összes MS-MS adatok megfelelő formába rendezve az egyes spektrumokkal független lekeresés az eredményeket viszont fehérjénként összegezzük

69

70

71 Nem igazi adatokhoz, hanem az elméleti spektrumhoz hasonlítunk!

72

73

74

75 Kovalens módosítások detektálása szerencsés esetben találhatunk ilyet is automatizált MS-MS analízissel lekereső programok lehetővé teszik a kovalens módosítások követését

76 Túl sok variációs lehetőség rengeteg félreértelmezést okozhat !

77 Schistosoma mansoni proteomikája G. Knudsen, J.H McKerrow, UCSF * kb. 200 millió ember fertőződik évente, bőrön keresztül, fertőzött vízben * Átmeneti hordozó – Biomphalaria glabrata * Kulcs a fertőzéshez: a cercaria által kiválasztott enzim-keverék

78 Egyszerű, jól ismert keverékkel van dolgunk... a csigából kibújt féreg-növendékeket jól lemossuk bőr-lipidekkel megindítjuk a kiválasztást a fehérje-oldatot bekoncentráljuk 1D SDS-PAGE fehérje-frakcionálásra gélben emésztés tripszinnel LC/MS/MS analízis Eksigent/Famous - 75  m ID PepMap column; 300 nL/min flow; water/ACN/0.1% HCOOH mobile phase, gradient elution, QSTAR; 1 sec MS/3 sec CID; single charged and dynamic exclusion

79 Mit találtunk? cercaria felszíni fehérjéket cercaria elasztázt és glikolitikus enzimeket csiga immunválasz-fehérjéket fotoszintézisben résztvevő fehérjéket humán keratint marha szérum albumint

80 Honnan jött mindez? a cercaria külsejéről ez az igazi! – a kiválasztott fehérjék az átmeneti hordozóból a salátából, amit a csigák ettek – éheztessük őket? a technikus kezéről? hajából? a laborból mindenütt – lehet, hogy takarítani kellene? Új, hatásosabb izolálási módszer→ az elasztáz-aktivitás 40x-esére nőtt!

81 Eddig csak kvali volt... Kvantitatív proteomika 1) a frakcionálás szintjén Pl. 2D gélek összehasonlítása vizuálisan, komputer programokkal, differenciál festéssel 2) az MS-analízis során

82 Az MS NEM kvantitatív módszer * a különböző molekulák nem egyformán detektálhatók pl. különböző peptidek relatív intenzitása nem tükrözi relatív mennyiségüket * nem minden komponenst detektálunk az elegyekből

83 Hogy lehet ezt legyőzni? csak nagyon hasonló peptidek relatív intenzitását vethetjük össze! 1) Jelöljünk két sejt-populációt hasonlóan, de megkülönböztethetően! 2) Keverjük össze az összes fehérjét! 3) A keveréket emésszük, analizáljuk! És így kvantizhatunk!

84 Hogyan jelölhetünk? ICAT – Cys-oldalláncának alkilezése, könnyű (H 8 ) és nehéz (D 8 ) alkil- csoporttal → amiben nincs Cys, az kiesik → a deuterált vegyület retenciós ideje kicsit hosszabb azonosítás: MS-MS alapon kvanti: MS-alapon relatív intenzitásokból ingadozás: van az 30% is!

85 Hogyan jelölhetünk? SILAC (stable isotope labeling) C 13, N 15, O 18 tápanyaggal visszük be – jelölt aminosav → Olyat kell választani, ami nem alakulhat át más aminosavvá, illetve nem szintetizálódik a sejtben Tripszines emésztéshez Arg a menő! a keveréket frakcionáljuk, emésztjük, analizáljuk azonosítás MS-MS alapon kvanti a relatív intenzitásból

86 Hogyan jelölhetünk? tripszines emésztés H 2 O 18 -ban Két oxigén lép be, minden peptid jelölődik Rengeteg információ Még a szekvenálás is könnyebb, a C- terminális ionok csúsznak DE beszárítás a normál emésztés után, hosszú enzimes inkubáció... → veszteségek, nem specifikus hasítások

87 Hogyan jelölhetünk? iTRAQ ™ (Applied Biosystems) Nagyon ravasz jelölés! amino-csoportra (N-terminus, Lys) 4-féle stabil izotópos szerkezet, azonos additív tömeggel, de különböző fragmensekkel (m/z 114, 115, 116, 117) azonosítás és kvanti az MS-MS adatokból!

88 iTRAQ jelölés  4 mintát kvantitatíve megkülönböztetni.  Minden peptidet jelöl, a módosítottakat is  Egyszerű a mintaelőkészítés  Jelnövelő hatású (szuperponálódik a 4-féle jel)  20%-nál kisebb standard deviáció  Jobb minőségű CID spektrumok  Poszt-transzlációs változásokat is lehet így mérni! Ross et. al. MCP 2004 DRÁGA

89 Mi ebből a tanulság?/ Take home message Ha biológus vagy → eredj programozást és statisztikát tanulni Ha matematikus vagy → irány a biológia Ha proteomikával akarsz foglalkozni → tömegspektrometria sem árt

90 Mi ebből a tanulság?/ Take home message Mennyiben lehet biológiai folyamatokat statisztikailag/matematikailag elírni? A komputer gyors, nem hibázik, „tanulékony”, de hülye... Mi emberek ellenben képesek vagyunk felismerni a váratlant, az újat – feltéve, hogy használjuk az eszünket....

91 Minta kérdések Mitől függ, mennyire jó egy adatbázis? Mi az oka, hogy nincs tökéletesen működő adatbázis-lekereső szoftver? Miért van szükség proteomikára? Miért kell „jelölni” kvantitatív proteomikában? Miért előnyös egy olyan jelölés, ami minden peptidet módosít? És valóban módosít-e minden peptidet?

92 Hasznos web-oldalak ProteinProspector – MS-BLAST - heidelberg.de/Blast2/msblast.htmlhttp://dove.embl- heidelberg.de/Blast2/msblast.html BLAST - European Bioinformatics Institute - Szekvencia-összehasonlítás – MS kezdőknek - „What is mass spectrometry” -


Letölteni ppt "Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Adjunct Professor of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai."

Hasonló előadás


Google Hirdetések