Enzimológia Lipáz enzimek Dr. Barta Zsolt Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék 2016.

Az előadások a következő témára: "Enzimológia Lipáz enzimek Dr. Barta Zsolt Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék 2016."— Előadás másolata:

1 Enzimológia Lipáz enzimek Dr. Barta Zsolt Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék 2016. 09. 26.

2 2 Lipidek Mi a lipid?  zsírsavak és származékaik (gliceridek és foszfolipidek)  zsírok (trigliceridek), viaszok  szteránvázas metabolitok (koleszterin) Funkciójuk  energia tárolás teljes oxidációjukkor kb. 9000 kcal/kg energia szabadul fel (szénhidrátból/proteinből kb. 4 kcal/g)  szignál molekulák  zsíroldható vitaminok (A, D, E, K) tárolása Jellemzőjük  hidrofób vagy  amfipatikus: hidrofil (víz-kedvelő) és lipofil (zsír-kedvelő)  vezikulumok, liposzómák, membránok Lipids a foszfolipidek amfipatikus jellege

3 3 Zsírsavak Felépítésük  szénhidrogén lánc  hidrofób  karboxil csoport  hidrofil  4-24 C-atom  telített vagy telítetlen  a természetes zsírok/olajok → legalább 8 C-atomos zsírsavak  C-lánc alfa(α)-végén karboxilcsoport (-COOH): vegyületképzés, másik végén: omega(ω) Néhány telített karbonsav / Saturated fatty acids jelölés: C-atomszám + kettős kötések száma (ezen esetben 0)  Ecetsav (etánsav; C2:0): CH 3 COOH  Vajsav (butánsav; C4:0): CH 3 (CH 2 ) 2 COOH  Laurinsav (dodekánsav; C12:0): CH 3 (CH 2 ) 10 COOH  Mirisztinsav (tetradekánsav; C14:0): CH 3 (CH 2 ) 12 COOH  Palmitinsav (hexadekánsav; C16:0): CH 3 (CH 2 ) 14 COOH  Sztearinsav (oktadekánsav; C18:0): CH 3 (CH 2 ) 16 COOH  Arachidinsav (eikozánsav; C20:0): CH 3 (CH 2 ) 18 COOH Fatty acids szabad zsírsav

4 4 Zsírsavak Telítetlen zsírsavak / Unsaturated fatty acids  legalább egy kettős kötés (-CH=CH-) a láncban  két H atom állása szerint: cisz- / transz-zsírsav  természetes, többszörösen telítetlen: ­kettős kötések között 2 egyszeres kötés ­cisz-konfiguráció (elhajlás lehetősége)  transz: többnyire mesterséges eredetű  kettős kötések helye: a) szénlánc "elejétől" (a karboxilcsoporttól, az alfa-szénatomtól) számítva b) végétől (a metilcsoporttól, az ún. ω-C-atomtól) → ω-3, ω-6, ω-9 zsírsavak Néhány telítetlen karbonsav jelölés: C-atomszám + kettős kötések száma + kötések láncvégtől számított helye   -linolénsav, ALA (oktadekatriénsav, C18:3 ω-3): CH 3 CH 2 CH=CHCH 2 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH  Linolsav (oktadekadiénsav, C18:2 ω-6): CH 3 (CH 2 ) 4 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH  Olajsav (oktadecénsav, C18:1 ω-9): CH 3 (CH 2 ) 7 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH  Erukasav (dokozénsav, C22:1 ω-9): CH 3 (CH 2 ) 7 CH=CH(CH 2 ) 11 COOH Fatty acids

5 5 Növényolajok zsírsavösszetétele %napraforgóolívarepcemogyorókukoricaszójapálmamag C6nd <0,8 C8nd 2-5 C10nd 3-5 C12laurinsavnd -0,1nd nd -0,1nd -0,3nd -0,144-51 C14mirisztinsavnd -0,2<0,1nd -0,2nd -0,1nd -0,3nd -0,215-17 C16palmitinsav5,6-7,68-143,3-6,08-147-178-137-10 C16:1nd -0,3<10,1-0,6nd -0,2nd -0,4nd -0,2<0,1 C18sztearinsav2,7-6,53-61,1-2,51,9-4,4nd -3,32,4-5,42-3 C18:1olajsav ω -914-3961-8052-6736-6720-4217-2612-18 C18:2linolsav ω -648-743-1416-2514-4339-6650-571-4 C18:3  -linolénsav ω -3nd -0,2<16-14nd -0,10,5-1,55,5-9,5<0,7 C20arachidinsav0,2-0,4<0,50,2-0,81,1-1,70,3-0,70,1-0,6<0,3 C20:1nd -0,2<0,40,1-3,40,7-1,70,2-0,4nd -0,3<0,5 C220,5-1,3<0,9nd -0,52,1-4,4nd -0,50,3-0,7 C22:1erukasav ω -9nd -0,2nd -2,0nd -0,3nd -0,1nd -0,3 C240,2-0,3nd -0,21,1-2,2nd -0,4 C24:1ndnd -0,4nd -0,3nd

6 6 Zsírsav-észterek - viaszok Mi a viasz? hosszú szénláncú alifás alkoholok + zsírsavak észterei (+ alkánok, egyéb észterek, poliészterek) Előfordulás  méhviasz  termés (pl. napraforgó) külső héján → véd a nedvességtől  magban (pl. nyers napraforgó olajban) Felhasználás  gyertya  kozmetikai ipar (viasz+zsír+pigment → rúzsok, szemfestékek)  édességipar  sajtok bevonása  textil, papír vízhatlanítása  cipő- és autóápoló, fa kezelő szerek  zsírkréta, színes ceruza, indigó papír Fatty esters – wax esters finomított rizskorpa- és napraforgó-viasz

7 7 Glicerolipidek Felépítésük  mono-  di-  triszubsztituált glicerin  Fischer képletben: a középső C atomon lévő zsírsav balra áll felül lévő C atom sn-1, alul lévő C atom sn-3 Trigliceridek / Triglycerides  glicerin észtere 3 zsírsavval  3 azonos / különböző alkillánc  alkillánc hossza változó, leggyakoribb: 16, 18, 20 C-atom  természetes növényi és állati zsírsavak: páros számúak, mert szintézisük során az acetil CoA 2 C-atomos acetát-csoportokat képes szállítani  baktériumok képesek páratlan C-atomszámú és elágazó láncú zsírsavak előállítására kérődzők zsírja is tartalmaz ilyet  zsírok / olajok: trigliceridek keveréke Glycerolipids http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/tag1/index.htm

8 8 foszfolipid Foszfolipidek / foszfatidok Felépítésük  glicerin +  2 zsírsav +  foszforsav +  1 N-t tartalmazó molekula (alkohol észteresíti a foszfatidsavat) Jellemzőik  amfipatikus vegyületek  amfipatikus vegyületek (víz & apoláris kh.)  vizes közegben cseppek/vékony hártyák sejtmembrán építőkövek  foszfatidsav: más foszfatidok alapvegyülete  ammónium-foszfatidok: élelmiszerekben (csokoládé- és kakaótart.) E442 névenemulgeálószer Glycerophospholipids / phospholipids glicerin-3-foszfát foszfatidsav

9 9 Foszfolipidek / foszfatidok Technikai lecitin  sárgás-barnás zsíros anyag glikolipidek, trigliceridek, foszfolipidek keveréke  előfordulása állati és növényi szövetekben, tojássárgájában (lekithos ógörögül)  kinyerése napraforgó olaj nyálkátlanítása (a szója allergén) → nyálka üledék (olaj, víz, lecitin) bepárlása  élettani hatása ­koleszterin-csökkentő (jó koleszterin-szint növelő) ­kötött P- és B vitamin (B8 és B11)-tartalom jó hatás az idegrendszerre, agyműködésre, memóriára ­a bélnedvben meggátolja egyes baktériumok elszaporodását  felhasználása ­tartósító- (antioxidáns hatás), emulgeáló-, stabilizálószer - E322 ­margarin-, csokoládégyártás, sütőipar ­takarmányipar (zsíradék, pelletképzés-javító) ­festékipar (stabilizáló, emulgeáló, rozsdaképződést gátló, színélénkítő) Glycerophospholipids / phospholipids foszfatidil-kolin / foszfátkolin

10 10 Lipázok Jellemzőik  lipidek észter-kötésének hidrolízisét katalizálják  egyensúlyi reakció  kis vízkoncentráció: katalizálják az alkoholok és savak észterképzését (lipid szintézis)  legtöbb mikrobiális lipáz mezofil, optimális körülményeik: pH 7-9, 30- 40°C termofilek: potenciális ipari jelentőség  Nem igényelnek kofaktorokat (ahogyan a hidrolázok egyike sem)  Affinitás csökken a di- és monogliceridek esetén Lipases 

11 Lipázok vs. észterázok  Határfelületi enzimek: az aktív centrumot borító „fedél” határfelület hatására felnyílik  határfelületi aktiváció (azonban nem mindenhol teljesül ez, így más megközelítésben 10 C atom szám feletti zsírsavakat tartalmazó lipidek hidrolízisét és szintézisét katalizáló észterázok) 11 Reakciósebesség VERGER, R; DEHAAS, GH. ANNUAL REVIEW OF BIOPHYSICS AND BIOENGINEERING Volume: 5 Pages: 77-117 Published: 1976 Reakciósebesség a szubsztrátkoncentráció függvényében máj észteráz és hasnyálmirigy lipáz esetén triacetin szubsztráton Az észterázok Michaelis-Menten kinetikát követnek, és oldatban lévő szubsztráton hatnak A lipáz aktivitás ugrásszerűen nő, ha a triacetin oldhatóságát meghaladja a szubsztrátkonc. (a telítettség >1)  két fázis van jelen, és a lipáz a közöttük lévő határfelületen aktív

12 12 Lipázok Reakcióik  észter hidrolízis  észter szintézis  átészterezés ­alkohollal ­észterrel ­savval Lipases Salleh et al. (Eds), New lipases and proteases, 2006

13 13 Lipázok Szerkezetük   /  hidroláz  többféle mechanizmus, többségük kimotripszin-szerű katalitikus triád: szerin (mint nukleofil) + savas aminosav (ált. aszparaginsav) + hisztidin Hol termelődnek az emberi szervezetben?  száj  gyomor  hasnyálmirigy Hol működnek?  a sejt bizonyos részében (lizoszómában)  extracellulárisan, a sejten kívül ­pl. hasnyálmirigyben termelt lipáz ­gomba vagy baktérium által termelt ­egyes méhek, darazsak mérgében foszfolipid-bontó enzimek csípés  fokozottabb sérülés, gyulladás Lipases

14 pH-stat módszer  Az észterek hidrolízisének követésére  hidrolízis kinetika vizsgálatára  Enzimaktivitás méréshez szintén használható  A pH-t mérhetjük pl. üvegelektróddal, vagy indikátorok alkalmazásával  A lipázok aktivitásmérését is leggyakrabban pH-stat segítségével valósítják meg  Állandó pH-t tartanak lúgoldat hozzáadásával  Ebben az esetben legtöbbször tributirint (a glicerin vajsav-észterét ) használnak szubsztrátként, de jellemző az olivaolaj emulzió is  A pH ilyen méréseknél jól követhető üvegelektróddal, mivel a felszabaduló vajsav vízoldható és az NaOH oldattal jól mérhetően titrálható.  Mikor van vége az enzimes reakciónak?  Hogyan számítható a konverzió ismert mennyiségű tributirint tartalmazó reakcióelegy esetén? 14

15 Lipid-víz kétfázisú rendszerek  I. Lipid emulzió A hidrofób tulajdonságok dominálnak  II. a) Lipid kettősréteg és b) Liposzóma Megjelenik töltés a molekulában Pl. foszfolipidek  III. Micella Egyre polárosabb a molekula Rövidebbek a zsírsavláncok Kis koncentrációban teljesen oldatban vannak CMC (kritikus micella koncentráció) felett gömb v. pálca, de optikailag tiszta a folyadék, gyors egyensúly Pl. detergensek 15 VERGER, R; DEHAAS, GH. ANNUAL REVIEW OF BIOPHYSICS AND BIOENGINEERING Volume: 5 Pages: 77-117 Published: 1976

16 Lipáz kinetika  Lipid emulzió a szubsztrát  Formailag a Michaelis-Menten kinetikához hasonló, de fontos eltérés a felületen történő adszorpció  Üres kör: kis zsírcseppek, teli kör: nagy zsírcseppek  „Felületi szubsztrátkoncentráció” esetén illeszkednek egy egyenesre 16 1/S S: anyagmennyiség/térfogat 1/S A S A : felület/térfogat VERGER, R; DEHAAS, GH. ANNUAL REVIEW OF BIOPHYSICS AND BIOENGINEERING Volume: 5 Pages: 77-117 Published: 1976

17 17 Lipázok ipari felhasználása Ipari felhasználás területei  régió- és sztereospecifikusak lehetnek, vagy szelektívek lánchosszra, kettős kötés helyzetére  tisztítószerek  tejipar  olajkémia (pl. biokenőanyag, szappanok eá.)  gyógyászat  kozmetikai ipar  sütőipar (javítja a tészta állagát, szerkezetét)  bőripar  bioremediáció  biodízelgyártás  Szennyvízkezelés, biogáz előállítás Industrial uses of lipases

18 18 Kereskedelmi lipázok Novozymes  olaj- és zsír feldolgozás  tésztagyártás, sütőipar  tejipar  kontakt lencse tisztítószer  bőripar  detergens ipar  textilipar  állateledel  papíripar  egyéb biokatalízis Commercial lipases

19 19 Lipáz források, termékek Enzimforrások / Sources  állati szövet ­hasnyálmirigy ۰marha, sertés ­fiatal kérődző előgyomra ۰kecskegida (pikáns sajt íz), borjú (vajas, kicsit borsos), bárány (pecorino, „koszos zokni”)  mikrobiális előgyomor enzimek helyettesítésére egyedi lipázok vagy enzimkeverékek ­bakteriális eredetű ­gomba eredetű ۰Aspergillus, Mucor, Rhyzopus, Candida nemzetségek Kereskedelmi termékek  folyadék extraktum  vákuum- vagy fagyasztva szárított  immobilizált Sources of lipases, products

20 20 Tisztítószerek Detergensek / Detergents  követelmények ­lúgos környezetben aktív ­kis szubsztrát specificitás ­kompatibilitás a detergensekkel  teljes lipáz termelés kb. 1/3-a  kereskedelemben 1988- (Lipolase - Novo Nordisk)  ipari és háztartási ­mosó- ­mosogató- ­egyéb tisztítószerekben  Mosás után a szárítás során a lipáz aktivitás jelentősen nő (következő dia, jobb ábra). Oka: 20-30% nedvességtartalmú szövet az optimális az enzimműködéshez. A folteltávolítás a következő mosás során hatékonyabb (következő dia, bal ábra). Detergents

21 21 Tisztítószerek Detergents Mosási ciklusok száma Fényvisszaverés 460 nm (%) Tiszta szövet 3000 U/l, szennyezet szövet 1000 U/l, szennyezet szövet 300 U/l, szennyezet szövet 0 U/l, szennyezet szövet Wolfgang Aehle (ed.) Enzymes in industry: production and applications, 2004

22 22 Tejipar - sajtgyártás Tejipar / Dairy industry  joghurtgyártás  sajtgyártás / cheese making, ripening ­vajzsír és tejszín bontása ­érés gyorsítása ­ízfokozás (főleg lágy sajtok jellegzetes ízének kialakítása) ۰lipáz  rövid láncú zsírsav (ált. C4, C6) felszabadítása  erős, csípős íz ۰lipáz  közepes lánchossz (C12, C14)  zsírosabb íz ۰lipázok részt vesznek egyszerű kémiai reakciókban  egyéb ízanyagok ­íz imitálás ۰utánozza a juh / kecske sajtok ízét  feta és egyéb sajtok tehéntejből ۰pasztőrözött tejből való sajtgyártásnál a nyers tejből előállítotthoz hasonló ízt ad ­EMC: enzim-módosított sajtok (USA) ۰a sajtot enzimmel termosztálják magas hőfokon  10x nagyobb zsírsavkonc.  szószokhoz, saláta-öntetekhez, levesekhez, rágcsálnivalókhoz Dairy industry – cheese making

23 23 Olajkémia Olajkémia ipar / Oleochemical industry  szerteágazó felhasználási lehetőség, de viszonylag kevés iparosított technológia ­konzervatív iparág (nagy beruházási költségek) ­nagy enzimárak  olcsó (és termostabil) enzimekkel lehet áttörni  60 M t zsír és olaj éves termelés a világon ­nagy energiaigényű kémiai átalakítások ­magas hőmérséklet, nyomás ­instabil termék  pl. többszöri desztillációs tisztítás ­többszörösen telítetlen, hőérzékeny olajok hidrogénezés nélkül nem dolgozhatók fel  kémiai technológiák  enzimes  energia megtakarítás  hőbomlás csökkentése  értéktelen/olcsó zsírok értékessebbé alakítása ­kémiai keverékekkel  random termékösszetétel ­lipáz enzimekkel specifikusan, pl. átészterezéssel kakaóvajat pálmaolajból (CBE - cocoa butter equivalents) Oleochemical industry

24 24 Olajkémia oktatas.ch.bme.hu/oktatas/konyvek/mezgaz/Biotermektech/BSc/Ipari enzimek 2.pdf Oleochemical industry Sztearinsav hozzáadása és kis vízaktivitású közeg (szerves oldószer)

25 Margaringyártás 25

26 Olajok enzimes nyálkátlanítása  Foszfolipáz A1 (sn-1 zsírsav hidrolízise), A2 (sn-2 zsírsav hidrolízise), C (foszfát csoporttól „balra”) és D (foszfát csoporttól „jobbra”)  Ipari alkalmazása az A2-nek van (eredetileg sertés hasnyálmirigy eredetű, de később mikrobiális termelés is)  Szűrésnél a nyálka gondot okoz  célszerű a nyálka (emulgeálószer) enzimes bontása, ezzel megszűnik az amfipatikus jelleg  EnzyMax folyamat ­pH 5.0, 60°C, 1-6 h (foszfatidtartalomtól és a termékminőségtől függ) 26 Casimir C. Akoh, David B. Min. Food Lipids: Chemistry, Nutrition, and Biotechnology, Third Edition Food science and technology. CRC Press, 2008

27 27 Gyógyszer-, Kozmetikai ipar Gyógyszeripar / Pharmaceutical Industry  szintetikus enantiomerek ált. racém keveréke van forgalomban, pedig csak az egyik izomer kellene lipáz: szelektív észterezést végez, pl. intermedierek eá. ­tiszta enantiomer gyomírtók ­nem-szteroid gyulladásgátlók (pl. ibuprofén) ­béta-blokkolók és egyéb szívgyógyszerek ­prosztaglandinok ­szteroidok  emésztést segítő gyógyszerkészítményekben Kozmetikai ipar / Cosmetic Industry  drága az enzim, de jobb minőségű a termék és kevesebb „downstream” művelet kell  speciális észterek eá. ­bőrápoló és napozókrémek, fürdőolajok ­viasz észterek Pharmaceutical, Cosmetic Industry

28 Biogázosítás – lipid hidrolízis gátolva ezzel az anyagtranszportot  Az olajok és zsírok közvetlen beadagolva a biogázosító reaktorba rátapadhatnak a bakteriális ökoszisztémát adó aggregátumok, flokkulátumok felületére, gátolva ezzel az anyagtranszportot a vizes fázis és a szilárd részecskék között. beépülve egyes baktériumok membránjaiba  Még ennél is kifejezettebb az az irreverzibilis gátlóhatás, amit az olajok és zsírok hidrolízisénél felszabaduló hosszúláncú zsírsavak – különösen a telítetlen zsírsavak – okoznak, beépülve egyes baktériumok membránjaiba, véglegesen meggátolva azok normális fiziológiai működését. Állattenyésztők  A metanogén baktériumok erősen gátolhatók hosszúláncú zsírsavakkal. Állattenyésztők ki is használják ezt a jelenséget, amikor takarmányhoz adagolva azokat, nagymértékben csökkenthető a kérődzők metántermelése. 3-szor annyi energianyeréssel  Másrészről a zsírsavak biogázosítása kb. 3-szor annyi energianyeréssel jár, mint a szénhidrátoké! 28

29 Biogázosítás – lipid hidrolízis a hidrolízis sebessége sokkal nagyobb, mint a biogázképzés sebessége  Az olajok és zsírok gyors hidrolízisét és ezáltal a gátló hosszúláncú zsírsavak felszaporodását a biogázosító reaktorban megakadályozni nem tudjuk, mivel a reaktorban jelentős lipáz aktivitás figyelhető meg, ezáltal a hidrolízis sebessége sokkal nagyobb, mint a biogázképzés sebessége. hosszúláncú zsírsavak Ca-sói  A hosszúláncú zsírsavak Ca-sói nem okoznak a fentiekhez hasonló gátlást, mivel oldhatóságuk vízben minimális. Ekvimoláris mennyiségû Ca 2+ szükséges a kívánt hatás eléréséhez,vagyis ha a hosszúláncú zsírsav (LCFA) és a Ca 2+ mólarányát fejezzük ki, akkor ha ez az arány : [LFCA] / [Ca] = 2,vagy ennél kisebb, akkor nincs gátlás.  Ugyanakkor CaCO 3 adagolása nem csökkenti a gátlóhatást. Miért? 29

30 Biogázosítás – lipid hidrolízis pH (üveg) elektróddal  Először megvizsgáltuk, hogy követhető-e a lipázos hidrolízis 3 fázisú (víz-olaj- oldhatatlan zsírsav-Ca sók) rendszerben manuális pH-stat módszerrel pH (üveg) elektróddal.  CaO zavar.  Fenolftalein  Fenolftalein: Ezért az újabb kísérletünkben először ismert mennyiségű CaO-ot adtunk a rendszerhez. Ennek hatására a fenolftalein lilaszínre váltott. Mértük azt az időt, ami az adott mennyiségű CaO elfogyásához szükségeltetett az időközben képződött zsírsavak hatására. fordulatszám  A fordulatszám nagymértékben befolyásolja a hidrolízis sebességét. Miért? 30 A Novozyme 871 lipáz enzim aktivitásának pH-függése

31 31 Biogázosítás – lipid hidrolízis

32 szigmoid enzim adszorpciója a határfelületen nulladrendű hidrolízis kinetikával A görbe szigmoid jellegű. Oka lehet a lipáz enzim határfelületen történő működése, amelynek első lépése az enzim adszorpciója a határfelületen. Valószínűleg ennek időben elnyújtott jellege okozza a furcsa kinetikai viselkedést. A kezdeti görbekésés után viszont jó közelítéssel lineáris szakasz következik. Ez viszont csak nulladrendű hidrolízis kinetikával indokolható. Ismert, hogy nulladrend esetében a sebesség és a sebességi állandó nem függ a szubsztrát koncentrációjától, vagyis: Integrálva S o és S t, ill. 0 és t között: ahol S 0 = a kiindulási szubsztrátkoncentráció, S t = adott t idő után még megmaradt szubsztrátkoncentáció, t = a reakcióidő [S 0 ]-[S t ] viszont egyenlő a termékkoncentrációval, ill. esetünkben áttételesen a CaO fogyással. 32 Biogázosítás – lipid hidrolízis

33 amikor a Ca-szappan csapadék jelentőssé válik a reakcióelegyben, akkor annak felületén kialakul egy olajfilm  Ezt a furcsa hidrolízis kinetikai viselkedést, t.i. hogy a szubsztrátkoncentráció nem változik a hidrolízisnek egy jelentős szakaszán – mert, ha változna, akkor nem nulladrendű összefüggést kellene kapnunk – csak úgy tudjuk magyarázni, hogy amikor a Ca-szappan csapadék jelentőssé válik a reakcióelegyben, akkor annak felületén kialakul egy olajfilm. Ennek a felülete határozza meg a hidrolízis sebességét. De a film felülete mindaddig nem változik, amíg már csak molekuláris fedettség nem lesz a csapadék felületén. Ha ez bekövetkezik, akkortól már csökken a szokásoknak megfelelően a hidrolízis sebessége. maradék olajfázis teljesen eltűnt, valószínűleg adszorbeálódott a csapadékon  Ennek egy indirekt bizonyítékát tapasztaltuk is, mert egy teljesen azonosan kivitelezett kísérletben reakció közben leállítottuk a lineáris szakasz közepe táján a keverést. Állás közben szétvált a rendszer szilárd csapadékká és vizes fázissá. A maradék olajfázis teljesen eltűnt, valószínűleg adszorbeálódott a csapadékon. 33 Biogázosítás – lipid hidrolízis