Előadás vázlat Definíció Történeti áttekintés

Az előadások a következő témára: "Előadás vázlat Definíció Történeti áttekintés"— Előadás másolata:

1 Áramlási citometria az orvosi diagnosztikában és gyógyszerkutatásban Dr. Milosevits Gergely

2 Előadás vázlat Definíció Történeti áttekintés
A műszer alapvető felépítése Mérhető paraméterek Alkalmazási területek Orvosi diagnosztika Mérések értékelése Ipari felhasználás Kutatás és gyógyszerfejlesztés

3 Mit jelent? Az áramlási citometria egy módszer,mely során…
folyadékban szuszpendált sejtek / részecskék áramolnak egyesével egy fényforrás előtt, ami alapján azok fizikai és / vagy kémiai tulajdonságaira következtethetünk a generált jelek detektálásával és elemzésével.

4 Az áramlási „partikulometria” kezdetei: 50-es évek
Elmqvist / Sweet tintasugaras nyomtató: tintacseppek áramoltatása, számlálása Wallace H. Coulter ( ) Coulter számláló: sejtek analízise áramló folyadékban „Vérkép”-elemzés

5 Az citometria fejlődése:
Becton & Dickinson: FACScan Herzenberg : - szorter funkcióval ellátott flow cytometer (1975) - FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter

6 Legújabb típusú készülékek:
Több lézer, detektálási hullámhosszsáv Hordozható „Megfizethető” ár: 12m Ft BD Accuri BD FACSVerse Összes elérhető laser-t tartalmazza Teljesen automatizált működés 96 well plate mintaadagoló

7 Alapvető felépítés Áramlási kör: Fényforrás: Detektorrendszer
Tartályok Csőrendszer Filterek Áramló köpenyfolyadék: PBS Fényforrás: Argon (488nm) laser / He- Ne (635nm) laser / He- Cd (325nm) laser/ UV Detektorrendszer Analóg-Digitális átalakító Számítógép + Software

8 Mérhető paraméterek Fluoreszcencia: Side scatter (SSC)
= laser által gerjesztett fény, melyet fluoreszcens festékek által jelzett részecskék emittálnak Side scatter (SSC) ≈ partikulum granularitás Forward scatter (FSC) ≈ partikulum méret

9 Detektálási lehetőségek
Sejt / részecske: natív mérés FSC, SSC Felszíni antigének Szekunder AT - Fluoreszcens festék Antitestek, citokinek Adszorbens gyöngy + szekunder AT- Fluoreszcens festék

10 Fluoreszcens festékek

11 Miért jó / nem jó? ELŐNYÖK Sok részecske gyors analizálása
Sejt sub-típusok kvantitatív meghatározása Natív mérés: olcsó Egyszerre több paraméter mérése HÁTRÁNYOK Karbantarás: körülményes, drága Fluoreszcens festékek, AT-k drágák (pl. FITC kötött AT: e Ft / ml) Méretkorlát: 0,3 és 150 μm

12 Mire jó / nem jó? MÉRHETŐ Sejtek / 300nm feletti részecskék
Hozzávetőleges méret, granuláltság Sejtfelszíni marker, DNS tartalom, ionáramlás, antitestek, citokinek (FL szek. AT és adszorbens gyöngyök közvetítésével) NEM MÉRHETŐ 300nm alatti vagy 150 μm feletti részecskék Pontos méret, szerkezeti felépítés Morfológia

13 Lehetséges alkalmazási terültek
Orvosi diagnosztika Infektológia Immunológia / Allergológia Hematológia Onkológia Gógyszerkutatás Immunogenitás vizsgálata Gyógyszerhatás felmérése Szerkezeti analízis

14 Elérhető rutin-laboratóriumi vizsgálatok
Vérkép CD4/CD8 sejtarány Th1/Th2 arány NK funkció, arány HLA-B27 meghatározás Immunglobulin szint meghatározás DNS tartalom és sejtproliferáció vizsgálata Bazofil aktivációs teszt Leukémia és limfóma „panel”-ek

15 DD.: Infektologia Teljes vérkép meghatározása Kalibrált automata:
pl. Abbot Cell-Dyn 3500 Multi-Angle Polarized Scatter Separation 0° : sejtméret 10° : sejtszerkezet és komplexitás 90° polarizált: nukleáris lebenyezettség 90° depolarizált : eosinophilek differenciálása

16 DD.: Infektologia Fehérvérsejtszám: Fiziológiás: Neu: 2000-7500/ µL
Ly: /µL Bakeriális inf: Neu: ↑↑↑ Ly: - Virális infekció: Neu: - Ly: ↑↑↑

17 Immunologia T-sejt meghatározás SEJT Citotoxikus T Th1 Th17 Tfh Treg
Károsító hatás Transzplant. rejekció Autoimmun betegségek Allergia Felszíni markerek CD8 CD4 CXR3 CCR6 CXR5 CD25 CCR4 Citokinek IFN-G, TNF TNF, IL17,-21,-22, -26 IL 21 TGF-B, IL 10 IL 4,-5,-6,-13 IL 9,-10

18 Immunologia T-sejt meghatározás CD4 CD8 CD3 CD3

19 Immunologia T-sejt meghatározás: Citotoxikus T T helper CD8 CD4 CD3

20 Immunologia Basophil aktivációs teszt: Aktivációs marker: CD63
pl. krónikus idiopátiás urticaria diagnózisa

21 Onkologia DNS tartalom analízis Elmélet: Gyakorlat:
Tumoros sejtek DNS tartalma nagyobb Nagyobb S és G2/M arány Gyakorlat: Sejt permeablitiásának fokozása DNS tartalom festése: propidium jodid – fokozza a fluoreszcenciát!

22 Haematologia Leukaemiák és limfómák DD. Sejtfelszíni markerek alapján
Utánkövetés: Minimális Reziduális Betegség (MRD) Retikulocytaszám meghatározás: Anaemia DD.

23 ALL VÉRKÉP: VVT ↓, THR ↓ , FVS (↑/−/↓)
( + ↑ LDH, karbamid, sülly.; periférián blasztok, máj-, vesefunkc. eltérések) Osztályozás.: Morfológia + genetika + immunologia! B-sejt: CD 10, 19, 20, 22 T-sejt: CD 2, 3, 5 Differenciálatlan: TdT; (HLA-DR; CD34) Gyors fenotipizálás citometriával!

24 ALL B-sejtes T-sejtes Pre-pre-B: + :TdT; CD19, -34; HLA-DR Pre-B:
+ : TdT; CD19; cyIgM; (CD10) Burkitt-ALL: + : CD19; SIgM; κ/λ; (CD10) - : CD34; HLA-DR Korai T: + : TdT; CD7; cyCD3 - : CD1 Átmeneti- T: + : TdT; CD1, -7 érett-T: + : SCD3; CD7; (TdT) Differenciálatlan: +: TdT; (HLA-DR; CD34)

25 AML VÉRKÉP: VVT ↓, THR ↓ , FVS (↑/−/↓)
Osztályozás.: Morfológia + genetika + immunologia! Myelocyta markerek: CD13, -33; cyMPO Monocyta markerek (M4,M5): CD14 Thrombocyta markerek (M7): CD41, -42, -61 Citometria! 2006-os Bethesda beosztás: CD7, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, CD45, CD56, CD117, HLA Dr

26 AML CD45 vs. SSC kapuzás: felismerhetők a myeloblastok

27 M0 / M1 / M2 AML (Myelocyta)

28 M3 AML (promyelocyta)

29 M4 / M5 AML (monocyta)

30 M6 AML (erythrocyta)

31 M7 AML (megakaryocyta) CD 42b CD 41

32 Ipari felhasználás Ivóvízben, fürdővízben baktériumok gyors kimutatása
Kalibrált automaták, gyors és olcsó analizálás Nagy mintaszám ellenőrzése Borászatban megfelelő élesztőkoncentráció mérése Tenyészállat nemzőképességének felmérése ivarsejtek számlálása DNS festés segítségével a viabilitás felmérése

33 Alkalmazás a kutatásban, gyógyszerfejlesztésben
Intracelluláris enzimek és ionok koncentrációjának mérése Membránpotenciál mérése DNS tartalom, sejtproliferáció, apoptózis vizsgálata MDR mechanizmusának vizsgálata Immunogenitás Aggregációvizsgálat In vivo és képalkotóval kombinált vizsgálatok

34 Ionkoncentrációk mérése
Indikátor alkalmazása: sejtbe áramlik → hidrolizálódik → → nem jut át a sejtmembránon → intracellulárisan felhalmozódik SBFI – Na+ PBFI – K+ FURA-2, INDO-1, Fluo-3 – Ca2+ BCECF – pH

35 Membránpotenciál mérése
Oxanol Membránpotenciálnak megfelelően oszlik meg a membrán két oldalán Depolarizáció hatására nő az intracelluláris oxanol mennyisége → fluoreszcencia fokozódik

36 Gyógyszerkutatás: MDR vizsgálata
Calcein festék, amely intracellulárisan felhalmozódik MDR pumpák a sejtből eltávolítják Intracelluláris jelenlétével arányosan változik a sejt fluoreszcenciája

37 Gyógyszerkutatás Apoptózis vizsgálata
Plazmamembrán változások: ANNEXIN V szintje emelkedik FITC konjugálva mérhető DNS fragmentáció Propidium jodidos festés: korai, késői apoptotikus sejtek és nekrotikus törmelék elkülönítése

38 Immunogenitás vizsgálata
Poliklonális és specifikus monoklonális antitestek vizsgálata Kvantitatív meghatározás IgA, IgE, IgM, IgG szintek mérése Módszer: multi-bead array Gyöngyökhöz kötött antitesek vizsgálata szekunder, fluoreszcens antitestekkel

39 Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata
Szupravezikuláris struktúrák vizsgálata liposzómális oldatokban Szabad-gyógyszer koncentráció hatásainak vizsgálata a liposzómális-gyógyszer stabilitására és aggregálódására

40 Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata
PBS puffer (A), lejárat előtti Caelyx (B), lejárat utáni Caelyx (C)

41 Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata
A: lejárat előtti Caelyx közvetlenül felbontás után B: lejárat utáni Caelyx C: lejárat előtti Caelyx nyitás után percekkel újra mérve

42 A jövő lehetőségei ZÁRT RENDSZEREK: Imaging flow cytometry
Morfológiai anamnézist is lehetővé tesz: az áramló részecskékről képfelvétel készül NYÍLT RENDSZEREK: LSC: Laser scanning cytometry Tárgylemezen lévő sejtek analízise: morfológiai elemzés és fluoreszcencia rögzítése In vivo citometria Tumorsejtek intravasális nyomonkövetése

43 Összegzés Az áramlási citometria alkalmas sok részecske gyors és többparaméteres kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára Alkalmazása széleskörben elterjedt, a mindennapi orvosi diagnosztikától, az alapkutatás számos területén át, az ipari felhasználásig. Különböző igényeknek megfelelően számos műszer működik ezen az elven, ami a teljesen automatizált analízist is lehetővé teszi Ez egy érdekes és hasznos módszer, amivel érdemes foglalkozni!

44 Köszönöm a figyelmet!