Földigiliszta reproduktivitási teszt OECD 222 Csató Henrietta Enikő 2010.12. 06.

A teszt típusa Laboratóriumi Egy fajt alkalmazó Állati + Könnyen elvégezhető laboratóriumban + Nem igényel drága műszereket - Kicsi a környezeti realizmusuk Állati Krónikus (reproduktivitási) Hosszú idejű vizsgálat Koncentráció–hatás görbe alapján grafikusan vagy statisztikai módszerekkel meghatározott értékeket szokták megadni (NOEC, NOEL, NOAEC, NOAEL, LOEC, LOEL, MATC)

A tesztorganizmus (Eisenia fetida – trágyagiliszta) Gyűrűsférgek törzsébe tartozik (nyeregképzők osztálya) Testük gyűrűzött, hengeres, csupasz, nyálkás bőr fedi Bőrük élettani funkciói: Légzés Fényérzékelés Védekezés Mozgás (összenőtt az izomzattal) Bőrtömlőjéből alakítja ki szaporító szervét – váladékából a petéit tartó gubót képzi A talajban lévő növényi anyagokat trágyává alakítják át, mellyel javítják a talaj minőségét. A földigiliszták jelenléte a talaj egészségét jelzi. Táplálkozásukkor a humuszos talaj egésze áthalad a bélcsatornájukon  innen az „ecosystem engineers” elnevezés

A tesztmódszer A vegyi anyagok toxicitásának mérése a földigiliszták szaporodásgátlásán alapszik A vizsgálat során felnőtt földigilisztákat tesznek ki a vizsgálandó anyag különböző koncentrációinak melyet a talajba, vagy annak felszínére raknak Az eljárás specifikusan alkalmazható a teszt céljától függően A tesztben alkalmazott koncentrációsort aszerint kell beállítani, hogy az szubletális és letális hatást is okozzon egy nyolchetes periódus elmúltával. A halálozásra és növekedésre kifejtett hatásokat a felnőtt egyedek esetén négyhétnyi expozíciós idő után meghatározzák.

A tesztmódszer A felnőtt gilisztákat ezután eltávolítják a talajról, hogy meghatározható legyen a szaporodás, melyet újabb négy hét eltelte után a talajban jelenlévő sarjadékok számával jellemeznek A szennyezőanyagnak és a kontroll környezetnek kitett giliszták szaporodásának összehasonlításával meghatározhatóvá válik az a koncentráció, melynek nincs megfigyelhető hatása (NOEC) és amely adott mértékű gátlást okoz (vagyis ECx-ek) Regressziós modellt használnak annak becslésére, hogy adott koncentráció mekkora százalékú szaporodás- csökkenést okoz.

A tesztmódszer Az illékony vegyi anyagokon kívül alkalmazható az összes vegyianyag-fajta toxicitásának meghatározására A teszt nem veszi figyelembe a vegyianyag csökkenését a teszt ideje alatt, emiatt a vegyianyag koncentrációjára nem kapunk valós kezdeti értékeket  Szükséges lehet egy analitikai meghatározás A tesztnek ki kell elégíteni a validálási kritériumokat ehhez referencia mérést kell végezni (1x 1 évben)

Szükséges felszerelés 1–2 literes üveg vagy más vegyileg közömbös edény Keresztmetszete hozzávetőlegesen 200 cm2 Az edény teteje gáz- és fényáteresztő (a giliszták ne tudjanak abból megszökni!) Normál laboratóriumi felszerelés szárítószekrény, sztereomikroszkóp, pH- és fotométer pontos mérleg, vízfürdő, hőmérők, páratartalom mérésére alkalmas eszközök, inkubátor, csipeszek, tűk

A mesterséges talaj előkészítése A tesztben alkalmazott mesterséges talaj összetevői: 10% moha tőzeg 20% kaolin agyag 0,3–1,0% CaCO3, az optimális, 5,0–6,0 pH fenntartásához 70%-osan száraz kvarc homok, túlnyomó részben finom homok (50–200 mikrométer) A talaj száraz alkotóit homogenizáljuk A talajt megnedvesítjük desztillált vízzel úgy hogy az hozzávetőlegesen a fele legyen a végleges víztartalomnak, ami a 40–60%-a a maximális víztartó kapacitásnak

A tesztállatok kiválasztása és előkészítése Eisenia fetida vagy Eisenia andrei fajok használhatóak 10 db kerül egy edénybe 2 hónapnál idősebb, de 1 évnél fiatalabb Azonos korstruktúrával jellemezhető tenyészetből kell kiválasztani Egy csoporton belül az egyedek korbeli különbsége max. 4 hét lehet Le kell mérni a tömegüket Előtte le kell őket mosni, és a felesleges vizet szűrőpapírral eltávolítani

A tesztelendő koncentrációk előkészítése A szennyezőanyag talajhoz adása kétféleképpen történhet: Talajba keverés Felületre adagolás Azt, hogy melyiket használjuk, a tesztelés célja dönti el, de általában a belekeveréses módszer a javasolt. Oldhatóságtól függően: Ha az anyag oldódik vízben, akkor desztillált vízben kell oldani a teszt kezdetekor Ha nem oldódik egy kis mennyiségű szerves oldószerben oldjuk fel, amit ezután hozzáadunk egy kis mennyiségű finom kvarc homokhoz. Az oldószert ezután elpárologtatjuk, majd a homokot az előnedvesített talajhoz adjuk.

A teszt összeállítása A nedves táptalajt a teszt edényekbe rakjuk A megmért gilisztákat a talaj felszínére helyezzük Az egészséges giliszták azonnal lyukat ásnak a táptalajba és eltűnnek a felszínről, azok a giliszták, amelyek a felszínen maradnak 15 perc elteltével is, nem tekinthetők alkalmasnak a teszthez, így azokat el kell távolítani a talajról. Az eltávolított giliszták helyére berakott új egyedeknek is le kell mérni a tömegét, hogy így a kezdésnél meghatározott legyen a kitett giliszták teljes élő tömege és az edény tömege a gilisztákkal együtt.  3. A tesztelendő anyag hozzáadása Nem adható a talajhoz a giliszták telepítésének félórájában (vagy amíg a giliszták a felszínen vannak), hogy nehogy közvetlenül érintkezzen a tesztanyag a giliszták bőrével. A tesztanyag hozzáadás előtt az edény tetejét le kell venni terelőt kell berakni, hogy a permetezés során beadott tesztanyag ne érje az edény falát. 4. A tesztedényeket fedő nélkül kell hagyni egy órára Az illékony oldószerek elpárologtatásának céljából.

Tesztkörülmények Hőmérséklet: 20 ± 2°C A fényt speciálisan kell beállítani A teszt során félsötétben lejátszódó, a fény által kontrollált folyamatok mennek végbe, amihez 400–800 lux megvilágítást kell alkalmazni az edényeken belüli területen. Az edények nem szellőzhetnek Azonban az edények tetejét úgy kell tervezni, hogy azokból a gáz távozhasson a teszt során. A táptalaj víztartalmának fenntartása Ehhez az edények tömegét periodikusan meg kell mérni. A csökkenést, ha szükséges, desztillált vízzel pótoljuk. A víztartalom nem növekedhet meg a kezdeti érték 10%- ánál nagyobb mértékben.

A giliszták etetése A giliszták testtömegének fenntartását szolgálja Zabdara, tehén- vagy lótrágya Trágya esetén meg kell vizsgálni, hogy a ló ill. tehén nem állt-e gyógyszeres kezelés alatt, hogy a trágya toxicitása ne befolyásolja a mérést. A trágyának szárítottnak és pasztőrözöttnek kell lennie.  Előetetést kell végezni egy nem tesztpopulációval Mindezt azért, hogy a trágya minőségről megbizonyosodjanak. Az első tápanyag-adagot a teszt indítása után egy nappal kapják meg Hozzávetőlegesen 5 g eleséget adnak a talajhoz, amihez 5–6 ml desztillált vizet is adnak Hetente 1x etetik meg a gilisztákat az első 4 hét alatt. Ha nem ennék meg a beadott táplálékot, akkor csökkenteni kell az adagot Az utolsó adag eleséget a 28. napon adják a talajhoz, a felnőtt giliszták eltávolítása után

A teszt értékelés A 28. napon az élő gilisztákat megvizsgálják és megszámolják. Minden szokatlan viselkedést (pl. azt, hogy nem képesek a földbe ásni) és alaktani változást (pl. nyílt sebek) fel kell jegyezni. Ezután az összes felnőtt gilisztát eltávolítják az edényből, megszámlálják és lemérik őket. A gilisztát tartalmazó talaj tálcára helyezése segít abban, hogy megtaláljuk a felnőtt gilisztákat. A gilisztákat mérés előtt megmossák és a felesleges vizet szűrőpapír csíkokkal távolítják el. Az értékelésnél a meg nem talált gilisztákat elpusztultnak nyilvánítják feltételezve azt, hogy azok már szétbomlottak A talajt további 4 hétre inkubálják, melynek végén megszámolják az ivadékokat, a kokonokat.   

A végpontok Letalitás Megkapjuk az ECx és NOEC adatokat Viselkedésbeli és alaktani változásokat a jelenlévő ivadékokkal együtt kell feljegyezni. Az LC50 értékeket probit analízissel vagy logisztikus regresszióval határozzák meg (akut toxicitás értékelési módja). 2. Termékenység (ivadékok száma). Megkapjuk az ECx és NOEC adatokat A krónikus toxicitási tesztek statisztikai értékelésében legfontosabb annak a koncentrációnak a meghatározása, amelynek eredménye szignifikánsan eltér a kezeletlen kontrollétól. Az értékeléshez az ANOVA statisztikai programot használják Az ANOVA alkalmazásának célja általában a MATC (a szennyezőanyag maximális, még megengedhető koncentrációja) meghatározása. Az ANOVA variancia-analízis folyamata: Az adatok transzformálása. A kezeletlen kontroll és a vivőanyagot (pl. oldószert) tartalmazó kontroll összevetése, azonosságának ellenőrzése. A kezelt csoportok variancia-analízise. A kezelt csoportok összehasonlítása annak megállapítására, hogy melyik különbözik a kezeletlen kontrolltól.

Forrás http://www.oecdbookshop.org/oecd/displ ay.asp?K=5LMNG4B4F4S4&DS=Test-No.- 222-Earthworm-Reproduction-Test- Eisenia-fetida/Eisenia-andrei www.wikipedia.hu

Köszönöm a figyelmet!