Diamino- pimelinsav meghatározása Készítette: Kelényi Janka

Kelényi Janka2 Diamino-pimelinsav (DAP) Diaminosavak csoportjába tartozik. Lizin ε-karboxi-származéka. Nem-fehérjeépítő aminosav. Baktériumok sejtfalának jellemzője. Jelenlétében normál növekedés, hiányában nem képesek új sejtfal- proteoglikánokat előállítani. Minden Gram-negatív baktériumban, azonban csak néhány Gram-pozitív baktériumban jelenik meg.

Kelényi Janka3 DAP A Braun-féle lipoproteinek diaminopimelinsavon keresztül kapcsolódnak a Gram-negatív sejtfalakhoz. A Gram-negatív Escherichia coli esetében diaminopimelinsavhoz közvetlenül kapcsolódik a szomszéd láncvégi D ‑ alanin. A sejtfal teichoinsav nélkül tömörebb, így kisebb rétegvastagság mellett is szilárd.

Kelényi Janka4 DAP meghatározás Grant és West egyszerűsített módszere Hidrolízis tömény sósavval Tisztítás Papír kormatográfiás vizsgálat Elemzés 80%-os visszanyerés

Kelényi Janka5 DAP meghatározás Mikrohullámmal gyorsított eljárás Egészsejtes hidrolízis folyadék és gőzfázisban lévő 6 N sósavval, lezárt edényben. Nyomás és hőmérséklet érzékelővel ellátott mikro használata. Folyadék- és gőzfázisú mikrohullámmal történő eljárással azonos minőségű eredmény nyerhető, mint a hagyományos módszerrel. A hidrolízis időtartama így óráról kevesebb, mint 10 percre csökkenthető A teljes vizsgálati idő kevesebb mint 90 perc A gőzfáziú megoldás esetében megkönnyíti az eljárás menetét a fázisok közötti sósavmosás elhagyása

Kelényi Janka6 Grant és West módszere I. Módszer elve: DAP extrakció talajból Hidrolízis HCl-al Mennyiségi meghatározás Vékonyréteg kromatográfia Anyagok és eszközök: Spektrométer Rotációs bepárló Kromatográfiás papír Rázógép Vízfürdő (25-100°C között állítható) Szűrőpapír Centrifuga és centrifuga csövek

Kelényi Janka7 Grant és West módszere II. Vegyszerek: HCl (12 M) trimetilkloroszilán (1% toluol) pellet NaOH Mozgó fázis I (30:20:6:24 V/V) –Bután-1-ol –Piridin –Ecetsav, tömény –Víz Mozgó fázis II (7:1 V/V) –Buán-1-ol –Hangyasav

Kelényi Janka8 Grant és West módszere III. Vegyszerek: (folytatás) Ninhidrin reagens –1g ninhidrin –100 mg kadmium-acetát –5 ml ecetsav –100 ml aceton –10 ml desztillált víz H 2 SO 4 (tömény) Metanol DAP standard oldat

Kelényi Janka9 Grant és West módszere IV. Eljárás: 3 db 2,5g talajminta bemérése Inkubálás rázógépen (100 fordulat/perc) –25°C –48 óra –20 ml HCl (12 M) Hidrolizálás –20 ml desztillált víz –105°C –18 óra Hidrolizátumok szűrése Maradékok kimosása 2x10 ml desztillált vízzel Lombik szililezése a felszíni DAP abszorpció megelőzésére Rotációs bepárlóval 45-50°C-on a szűrőket kiszárítjuk (3x)

Kelényi Janka10 Grant és West módszere V. Eljárás: (folytatás) Semlegesített hidrolizátumot desztillált vízbe visszaoldjuk Huminanyagok eltávolítása centrifugálással A felülúszókat adott térfogatra egészítjük ki DAP meghatározás –Whatman papír –2 cm-es távolságban viszik fel az egyes mintákat –72 óra Levegőn szárítása a kromatográfiás papíroknak Ninhidrin reagensbe mártás

Kelényi Janka11 Grant és West módszere VI. Eljárás: (folytatás) Folt előhívása, kivágása –24 órán belül –Tömény H 2 SO 4 -val –Sötétben A foltok eluálása 4 ml metil-alkohollal 500 nm-en spektrofotometriás mérés Minden kromatográfiás papírból kivágunk egy ugyanakkora darabot (vak minta), mint a mintáknál és mossuk 4 ml metil- alkohollal. Ezzel a háttér-abszorbancia értékkel korrigálunk a mérés során.

Kelényi Janka12 Grant és West módszere VII. Eredmények: Érzékenysége kb. 10 μg/ g talaj Extrakciós veszteség max. 38 % Talaj élettelen szerves frakciójában megjelenik a DAP

Kelényi Janka13 Felhasznált irodalom delfin.unideb.hu/~szentirm/mikrobana.doc Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995

Köszönöm a figyelmet! Kelényi Janka