Közönséges trágyalégy fejlődésére gyakorolt toxikus hatás vizsgálat OECD 228 teszt Készítette: Ladoneczki Gábor 2010.11.29.

Bevezetés Ez a teszt vegyi anyagok trágya-függő kétszárnyú fajokra gyakorolt hatását méri Két fő indikátorfajt alkalmaz rovarirtók toxicitásának vizsgálatára, a hatások előrejelzésére (többnemzedékes, könnyen tenyészthető, rövid életciklusú rovarok): Scathophaga stercoraria Musca autumnalis A fauna védelmét szolgálja a trágya szennyezettségétől nagy érzékenységű indikátorfajok segítségével Ez a két faj nem reprezentálja az összes trágyalakó élőlényt

A tesztorganizmusok – Scathophaga stercoraria Forrás: http://bugguide.net Kerry S. Matz (2005) Forrás: http://bugguide.net Tim Nichols (2004)

A tesztorganizmusok – Musca autumnalis Forrás: http://www.eol.org/pages/730042 BioImages (2007) Forrás: http://en.wikipedia.org James K. Lindsey (2006)

A teszt alapelve Trágyához köthető életciklusokban történő fejlődést gátló, befolyásoló hatásokat méri Marhatrágyába jutatott vegyi anyagot vizsgál A trágyába petéket (S. stercoraria) illetve lárvákat (M. autumnalis) helyezünk tesztelés céljából Lehetséges hatások vizsgálata a tesztorganiz-musok kifejlődésére (viszonyítás a negatív kontrollhoz) Végpontok kontrollált körülmények közti mérése

Lehetséges mérési végpontok Kifejlődött legyek száma és neme Fejlődésgátlás, a fejlődési rátával kifejezve Alaktani változások: testméret változása fejlődési rendellenességek stb. Származtatott végpontok: NOEC ECx

A tesztvegyület tulajdonságai Erősen javasolt a következők ismerete: vízoldhatóság, Kow, gőznyomás, tesztvegyület lebomlási ideje. Szükséges még a teszt- és referenciavegyületek eredetének, Mennyiségének és tisztaságának ismerete. Ez a teszt vízoldható vagy gyengén vízoldható anyagokhoz használható

Referenciaanyag Ivermectin javasolt referenciaanyagként Rendszeresen tesztelendő: ECx meghatározása évi 1-2 alkalommal vagy Párhozamosan a vizsgált vegyi anyaggal (javasolt) Új legyek első vizsgálata esetén a referenciaanyag mindig újra tesztelendő Forrás: http://www.inchem.org

Érvényesség A teszt érvényesnek tekinthető ha a kontroll mintákban: az elhelyezett lárvák kikelése a petékből ≥ 70% (S. stercoraria) felnőtt egyedek kialakulása a kikelt lárvákból ≥ 70% (S. stercoraria) felnőtt egyedek kialakulása az elhelyezett petékből ≥ 60% (M. autumnalis) a felnőtt egyedek kifejlődése elkezdődik 18 ± 2 nap (S. stercoraria) illetve 13 ± 2 nap alatt (M. autumnalis) Ellenkező esetekben a teszt nem érvényes (kivéve indokolt esetekben)

A szükséges felszerelés Megfelelő méretű edények Pamut anyag a szellőzés biztosítására Szárítószekrény Sztereomikroszkóp Ecset a lávák/peték elhelyezéséhez pH-mérő, fényerősségmérő Hitelesített mérleg Megfelelő eszköz a hőmérséklet szabályozására Megfelelő eszköz a páratartalom szabályozására

Trágya kiválasztása és begyűjtése Dokumentált állatorvosi kórtörténettel rendelkező szarvasmarha-állományból származó, nem szennyezett (gyűjtést megelőzően minimum 8 hétig gyógyszerészeti készítmény, illetve minimum 5 hónapig féregirtó használatának mellőzése) marhatrágya. A trágya közvetlenül az állatból vagy a földről (2 órásnál frissebb) gyűjthető. A trágya fagyasztható. A minták víztartalma és pH-ja meghatározandó. Forrás: http://www.righthealth.com

A tesztállatok kiválasztása és előkészítése A trágyalegyek ismert laboratóriumi tenyészetből szerzendők be. A fajok azonosítása szükséges. Az egyedek forrása és eredete dokumentálandó. A frissen rakott petéket/lárvákat (12 óránál fiatalabbak) kell a tesztekhez felhasználni.

A tesztkörülmények S. stercoraria M. autumnalis T = 20°C ± 2°C Relatív páratartalom (RH) > 60% (a teszt első fázisában) M. autumnalis T = 26°C ± 2°C 16:8 órás világos:sötét ciklusok A fényintenzitás a teszt elején feljegyzendő

Eljárás – a trágya előkészítése 1/2 A friss vagy a kiolvasztott trágyát homogenizálni kell ~10 percig A nedvességtartalom megváltoztatása nem szükséges A nitrogén- és széntartalmat meg kell határozni, az eljárást fel kell jegyezni

Eljárás – trágya előkészítése 2/2 A koncentrációkat száraz tömegre kell megadni Ismert mennyiségű trágya bemérése a keverőbe A tesztelt és a referenciavegyületeket fel kell oldani vízben vagy szerves oldószerben Majd 10 percig kevertetni kell a rendszert Kontrollhoz az oldószer vagy a víz hozzáadása Oldószer használata esetén minimum 4 óráig (szobahőmérsékleten) állni kell hagyni, hogy elillanjon Az alkalmazott vegyi anyagok koncentrációját pontosan meg kell határozni

Eljárás – tesztállatok elhelyezése 100 g (frissen mért) trágyát kell elhelyezni az edényekben úgy, hogy 5—8 cm mély legyen A peték vagy a lárvák szolgálnak a teszt kezdőpontjaként A lárvák/peték kis csoportokban helyezendők el A vizsgálatig a petéket nedvszívó papíron kell tárolni 10 lárvát/petét kell elhelyezni a trágya felületén A petéket (S. stercoraria) nedvszívó papírra kell rakni, hogy kikeljenek, a kikelést követően belemásznak a trágyába Amikor a M. autumnalis lárvák elmerülnek a trágyába és már nem láthatóak felitatószerrel (száraz vermikulit) kell betakarni 3 cm vastagon

Eljárás - megfigyelések Peték alkalmazása esetén a kikelt lárvák számának meghatározása az elhelyezést követően 48 órával A tesztidőszak alatt a kifejlett példányok számának, nemének és a túlélésének dokumentálása naponta Alaktani megfigyelések Kifejlett állatok eltávolítása naponta Kikelés: S. stercoraria a 18. napra tehető M. autumnalis a 13. napra tehető A teszt vége 5 nappal az utolsó felnőtt egyed felbukkanását követően

A teszt típusa Hatásos koncentrációtartomány keresése (angolul: Range Finding Test): Ismeretlen toxicitású vegyi anyag esetén Koncentrációk: 0,1; 1; 10; 100 és 1000 mg/kg (trágya száraz tömege) Kontroll és szerves oldószer esetén oldószeres kontroll minta Határteszt (angolul: Limit vagy Definitive Test): Ha NOEC nagyobb az 1000 mg/kg-nál Jellemzően 1000 mg/kg koncentrációban 8 vegyi anyaggal (plusz 8 kontroll, referencia oldószeres kontroll) OECD 54-es dokumetum alapján

NOEC és ECx meghatározása Minimum 5 koncentrációban mérendő 4 párhozamossal és 8 kontrollal javasolt A koncenrációköz ne haladja meg az 1,8-as faktort ECx Minimum 12 koncentrációban mérendő Minimum 2 párhuzamos és 6 kontroll javasolt A koncenrációköz 2-es faktornál legyen kisebb, a várt értékeknél A statisztikai kiértékelés típusa szabadon megválasztható

Jelentés 2/1 A teszt végeztével összefoglaló jelentést kell készíteni, melynek a következőket kell tartalmaznia: Tesztvegyület: vegyi anyag, referencia anyag és tulajdonságaik Tesztorganizmusok: felhasznált fajok és kezelésük, koruk az edényekbe való elhelyezéskor

Jelentés 2/2 A teszt körülményei: trágya származása és tulajdonságai, a trágyaszint az edényekben, felhasznált eszközök, hígítási sorok és párhozamosok száma, a tesztelt és felhasznált vegyi anyagok előkészítésének folyamata, a teszt körülményei Eredmények: kifejlett nőstény és hím egyedek száma (db/nap/edény), százalékos eredmények, élettani elváltozások, fejlődési ráták, kikelési ráták, eredmény a referencia anyagra viszonyítva, eredmények numerikus és grafikus formában, végpontok meghatározása Az eredmények értékelése: érvényesség-vizsgálat, az eredmények értékelése, levont következtetések

Forrás OECD Test No. 228: Determination of Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung Flies (Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae)) http://puck.sourceoecd.org