Léptetés: nyilak, szóköz, egér görgő, PageUp/PageDown Animált bemutató, ajánlott bekapcsolni a diavetítést (pl. az F5-öt megnyomni) Léptetés: nyilak, szóköz, egér görgő, PageUp/PageDown

A koncentráció meghatározása Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl: szín (abszorbancia, optikai denzitás) fluoreszcencia sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad A standard hígítási sora (szigmoid görbe) OD Ismeretlen koncentrációjú minta Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 1000 0.97 0.49 0.24 0.12 0.061 0.030 0.015 0.007 0.004 koncentráció Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani. 3

A két csőben azonos a koncentráció Becslés „vonalzóval” Tehát az (eredeti hígítatlan) ismeretlen minta koncentrációja: 1.9x128 = 243.2μg/ml OD A két csőben azonos a koncentráció Az a tartomány, ahol az abszorbancia arányos a koncentrációval azonos OD-hoz tartozó pontok Az 1.9μg/ml-re hígított standard megfelel a… Egyenes egyenletébe a felső vagy alsó telítési rész adatait behelyettesítve és a hígítással felszorozva hülyeséget számol az ember!!! 1000 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 0.97 0.49 0.24 0.12 0.030 0.061 0.007 0.015 0.004 0.002 standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) … 128-szorosra hígított ismeretlen mintának 2X 4X 8X 16X 32X 64X 128X 256X Ismeretlen minta hígításai 4

standard koncentráció (µg/ml) Ha felírjuk az egyenes szakaszok egyenleteit, eltehetjük a vonalzót, és elővehetjük a számítógépet OD Yminta=mx+b ystd=mx+b Vegyük észre, hogy az x tenglyek eltérő skálázása miatt (piros ill. kék feliratok), a két egyenes nem párhuzamos egymással! 1000 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 0.97 0.49 0.24 0.12 0.030 0.061 0.007 0.015 0.004 0.002 standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) 2X 4X 8X 16X 32X 64X 128X 256X Ismeretlen minta hígításai 5

Durva hibák Tudatában kell lenni, hogy milyen abszorbancia érték tartományban használhajuk fel az OD értéket, ha egy egyenletbe szeretnénk visszahelyettesíteni, és az alapján koncentrációt számolni! OD Illeszett egyenes, egyenlettel y=mx+b  OD=m(koncentráció)+b Hígítási görbe Hasonló mondható erről az értékről is A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek Egyenes egyenletébe a felső vagy alsó telítési rész adatait behelyettesítve és a hígítással felszorozva hülyeséget számol az ember!!! Bármely töménységű oldat kellően nagy hígításának OD-je erre a részre fog esni. Az egyenletbe ezt az OD értéket behelyettesítve, és ez alapján a hígítást is figyelembevéve (visszaszorozva), óriási – hamis! – koncentációt kapunk eredményül koncentráció

A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek Ne erőltessük az egyenes illesztést ott ahol felesleges OD Hígítási görbe A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek hibásan illesztett egyenes Gyakran illesztenek így hibásan egyenest, pl. ha nem logaritmikus ábrázolást használnak Az egyenest is ezekre a pontokra kell illeszteni koncentráció

Vegyük észre, hogy a hígítás/koncentráció tengelye a korábbi ábrákon logaritmikus ábrázolású volt! Ugyanannak a sorozathígítással kapott mérésnek az ábrázolása: Normál (lineáris) hígítási tengellyel Logaritmikus hígítási tengellyel A jó ábrázolás segít a kiértékelésben, segíti megtalálni azokat a pontokat, amikre egyenes illeszthető!

hígítás: 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 = hígítás 2x: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

A jó ábrázolás segít a kiértékelésben Próbáljuk meg meglátni a hígítási sorozatokban a „szigmoid görbe” megfelelő részeit, akkor is, ha a függvényben nem ábrázolódik teljesen, és ennek megfelelően illeszteni az egyenest

érzékenységi küszöb körüli érték 1.0 1.1 A gyakorlatban csak ritkán adatik meg, hogy szép sztenderd hígítási görbével dolgozhassunk. Az ismeretlen mintából sem szokás teljes szigmoid görbét kiadó hígítási sorozatot készíteni. Általában csak 2-3 féle hígítást készítünk belőle. OD 4.5 az ismeretlen minta hígításai hígítás 1x 10x 100x OD 4.0 2.1 1.1 standard (1x: 100 mg/ml) 4.0 3.5 3.0 az ismeretlen 20x10 = 200 mg/ml 2.5 2.1 2.0 1.5 érzékenységi küszöb körüli érték 1.0 1.1 1x 2x 4x 8x 16x 32x 64x 128x hígítás kb. 5 (a pontos érték kiszámításához pl. a két pont közti egyenes egyenletét lehetne felhasználni) 100/5 = 20 mg/ml

az ismeretlen minta hígításai Felhasználjuk-e a megmaradt adatpontot? az ismeretlen minta hígításai hígítás 1x 10x 100x OD 4.0 2.1 1.1 OD 4.5 standard (1x: 100mg/ml) 4.0 4.0 A 4.0 OD érték körüli érték a legtöményebb sztenderd hígítási pont! 3.5 3.0 Lehet, hogy a sztenderd hígítási görbe valójában más lefutású! 2.5 2.0 1.5 1.0 1x 2x 4x 8x 16x 32x 64x 128x hígítás pl. ha a hiányzó 2x hígítás ide esik Ez a szigmoid görbe felső plató része! Ebben a példában a hígítatlan (1x) ismeretlen minta OD értéke valószínűleg nem lett volna használható.

(pl. OpenOffice, MS Excel) A kiadott példák megoldásához szükségünk lesz valamilyen spreadsheet / táblázat kezelő programra (pl. OpenOffice, MS Excel)

Számoljuk ki az ismeretlen minta anti-BSA tartalmát! A standard minta koncentrációja 100μg/ml.

Írjuk be a következőket: a hígítás logaritmusát,… a párhuzamos standardok átlagát,… és a párhuzamos minták átlagát kiszámoló képletet!

Kattintsunk a diagramm varázslóra Jelöljük ki a képleteket tartalmazó sort, és a kijelölés jobb alsó sarkában levő kis négyzetet megfogva húzzuk (másoljuk) le a többi sorba. Kattintsunk a diagramm varázslóra

Válasszuk ki a „Pont (XY)” diagramtípust Válasszuk az adatsor fület Hozzáadás

Írjuk be az ábrázolandó adatsor nevét Jelöljük ki a hígítás értékeit Adjuk meg a hígítás értékeit Adjuk meg a standard OD értékeit Jelöljük ki a standard OD értékeit

Végezzük el ezeket a műveleteket az ismeretlen minta adataival is

A standard 5. -8. pontjaira és az ismeretlen 2. -5 A standard 5.-8. pontjaira és az ismeretlen 2.-5. pontjaira egyenes illeszthető

A standard lineáris szakaszának adatai ! Az ismeretlen lineáris szakaszának adatai ! Ezeket az adatokat felhasználva ábrázolni tudjuk a lineáris részt, pl. az előzőekben bemutatott módon egy külön diagrammon. (Vigyázzunk, hogy a megfelelő hígítási értékeket válasszuk ki az adatok ábrázolásánál!)

Kijelölve az egyenest kiválsztjuk a trendvonal illesztése pontot (A jobb egérgombbal) Kijelölve az egyenest kiválsztjuk a trendvonal illesztése pontot

Egyenlet megjelenítése Lineáris trendvonal (Egyebek) Egyenlet megjelenítése

Ugyan ezt megcsináljuk az ismeretlennel is A standard egyenlete Ugyan ezt megcsináljuk az ismeretlennel is (vegyük észre, hogy azonos hígítási lépések mellett a vonalak meredeksége elvileg azonos)

Az egyenletekkel kiszámíthatjuk, hogy egy adott OD érték mellé milyen hígítások tartoznak ismeretlen: y = -0.6078x + 3.8421 standard: y = -0.6189x + 5.6945 pl. OD 1.5  x=3.85 OD 1.5  x=6.78 Az 53.85=491 –szeres hígítású ismeretlen felel meg… …az 56.78=54830 –szoros hígítású standardnak. Az ismeretlen 54830/491= kb.112x hígabb a 100µg/ml-es standardnál 0.89 μg/ml

Megjegyzés A bemutatott számítás egy demonstratív példa! Ennél egyszerűbben is eljuthatunk a megoldáshoz! (pl. elég a standard hígítási egyenes egyenletét kiszámolni, és ezt összevetni egy megfelelően kiválasztott ismeretlen minta OD értékével)