Élősejtszám meghatározás 1. gyakorlat

Mikrobaszám meghatározási módszerek Összes mikrobák (élő és holt együttes) számának meghatározására alkalmas módszerek Élő (tenyészthető) mikrobák számának meghatározására alkalmas módszerek

Élő mikrobaszám meghatározási módszerek Szilárd táptalaj alkalmazásával Lemezöntés Szélesztés Membránszűrés Folyékony táptalaj alkalmazásával MPN

Táptalajok Csoportosításuk Halmazállapot szerint Összetevők szerint Alkalmazásuk szerint

1. Halmazállapot szerint Folyékony Szilárd Agar (olvadáspont: ~90 °C, dermedéspont: ~40°C) Zselatin Szilikagél Félfolyékony

2. Összetevők szerint Természetes: természetes anyagok felhasználásával készülnek, ezért összetételük pontosan nem definiálható Szintetikus: minden összetevőjét kvantitatíve és kvalitatíve is ismerjük Félszintetikus: minden agart tartalmazó táptalaj

Táptalajok összetevői Víz: vízaktivitás szerepe a szaporodásban Szénforrások: CO2 – csak autotróf mikroorganizmusok szénhidrátok, mono-, oligo- és poliszaharidok Húskivonat, pepton (N-források is) Nitrogén források: N2 – Rhizobium és Azotobacter species Szerves: Húskivonat, proteinek (tej, szója), peptonok, amino savak Szervetlen: Ammonium sók: (NH4)2SO4 Nitrátok: KNO3, NaNO3 Nitritek: KNO2, NaNO2

Táptalajok összetevői Ásványi anyagok: Kationok: K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+ Anionok: PO43-, HPO42-, H2PO4-, Cl-, CO32-, HCO3- Vitaminok, biosz anyagok: Élesztő kivonat Speciális kiegészítők

3. Felhasználás módja szerint Általános Elektív Szelektív Differenciáló Speciális

Általános (alap) táptalajok Olyan táptalajok, amelyek összetételüknél fogva általánosan (de nem univerzálisan) használhatók. A szaporodáshoz szükséges tápanyagokon kívül más speciális anyagot nem tartalmaznak.

Elektív táptalajok Olyan táptalajok, amelyek összetételüknél fogva csak bizonyos mikrobacsoportok minimális tápanyagigényét elégik ki, így azok a környezetükben élő kísérő mikroflórából kiemelhetők.

Szelektív táptalajok Olyan kiegészítő komponenst tartalmaznak,amelyek egyes mikrobacsoportok szaporodását gátolják (pl. antibiotikumok, festékek,szulfonamidok stb.). Gyakran tartalmaznak olyan alkotókat is, amelyek a keresett, mikrobacsoport szaporodását segítik. A szelektív táptalajok közétartoznak a módosított pH-jú (erősen savas vagy lúgos) táptalajok is.

Differenciáló táptalajok A mikroorganizmusok differenciálására, azonosítására szolgáló táptalajok, amelyek kémiai indikátort, vagy egyéb jelzőrendszert (pl. Durham-féle fermentációs cső) tartalmaznak, amely speciális reakciókat (pl. savtermelést) jelez. Jellemzőjük, hogy egyes komponenseik szabad szemmel is látható reakciót adnak a mikroorganizmusok bizonyos anyagcseretermékeivel vagy enzimeivel. Jellegzetes képviselőik a kromogén és fluorogén táptalajok

Chromocult® Coliform Agar (Merck) sötétkék: E. coli, rózsaszín: Coliformok

Speciális táptalajok Különböző vizsgálati céllal összeállított, különleges vizsgálatokat szolgáló tápközegek.

Mikroba tenyésztési módszerek Tenyésztés szilárd táptalajon Alap feltételezés: minden egyes mikroba képes növekedni és különálló, látható telepet képez. Tenyésztés folyékony táptalajban Alap feltételezés: minden egyes mikroba képes növekedni és a táptalajban látható elváltozást okoz

Táptalajok beoltása Oltási módszerek: Táptalajba keverés Szélesztés Beszúrás

Élősejtszám meghatározási módszerek Lemezöntés Szélesztés Membránszűrés Határhígítás Szilárd táptalaj Folyékony táptalaj

Élősejtszám meghatározás szilárd táptalajon 1. Hígítási sor készítése A vizsgálandó mintából úgy kell hígítást készíteni, hogy legyenek olyan lemezek, amelyeken a telepek megszámolhatók (max. 300 telep/Petri-csésze) Általában 10-es alapú hígítási sor Az első hígítás általában 10 g minta + 90 ml hígító folyadék, amelyet megfelelő módon homogenizálni kell Stomacher Késes homogenizáló Egyéb A további hígítási tagok: 1 + 9 ml

Hígító folyadékok Fiziológiás konyhasó oldat Sós pepton Peptonvíz A hígító folyadék nem változtathatja meg a táptalaj szelektivitását!

Hígítási sor készítése 1. A minta kimérése (ált. 10 g) A hígító folyadék hozzáadása (90 ml) Aprítás, homogenizálás

Hígítási sor készítése 2. 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 90 ml +10 g 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml A hígítás száma: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Hígítási fok (d): 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Lemezöntés Hígítási sort készítünk Minden hígítási tagból 1 ml-t mérünk (steril) pipettával a (steril, általában 90 mm átmérőjű) Petri-csészébe A Petri-csészékbe 18-20 ml, felolvasztott és kb. 45 °C-ra visszahűtött táptalajt öntünk. (Az agar vastagsága ~3 mm) Alaposan (váltakozó irányú, körkörös mozgatással) elkeverjük Hűtjük megszilárdulásig Inkubáljuk az előírt hőmérsékleten és ideig (fedéllel lefelé!) A lemezeken megszámoljuk a kinőtt telepeket Ha a mikroba hajlamos a szétfutásra (pl. Proteus), a táptalajt megszilárdulás után felülrétegezzük tiszta agarral, vagy a felhasznált táptalajjal (~5 ml)

Szélesztés Hígítási sor készítése Az előre megszilárdított és páramentesített lemezek felületére 0,1 ml-t felcseppentünk A cseppet a felületen steril üveg, vagy műanyag eszközzel elszélesztjük, úgy hogy a steril eszközzel az agar-lemez teljes felületén szétkenjük, majd a lemezt 90 °-kal elforgatva a műveletet többször megismételjük, anélkül, hogy hozzáérnénk a Petri-csésze falához Inkubáljuk az előírt hőmérsékleten és ideig (fedéllel lefelé!) A lemezeken megszámoljuk a kinőtt telepeket Abban az esetben, ha kis mikrobaszámot kell meghatároznunk szélesztéssel, 1 ml-t szélesztünk 140 mm átmérőjű Petri-csésze felületén, vagy 3 db 90 mm-es Petri-csészén

Membránszűrés Alkalmazása: Szűrhető folyadékokban (pl. víz, üdítőitalok) kis mikrobaszámok meghatározására Mikrobaszaporodást gátló anyagot tartalmazó folyadékok mikrobaszámának meghatározására Szűrhető folyadékok sterilitásának vizsgálatára Élelmiszeriparban általában 47 mm átmérőjű, 0,45 µm pórusméretű membránt használunk A leszűrendő folyadék minimális mennyiségét úgy kell megválasztani, hogy az a membrán teljes felületén szétterüljön (ált. min. 10 ml), maximális mennyiségét, úgy, hogy a membrán pórusait ne tömje el, illetve a szűrés ideje alatt a membrán ne szakadjon el

Membránszűrés Felhelyezzük a steril membránt a membránszűrő készülékre Rácsavarjuk a tölcsért A szűrendő folyadék megfelelő mennyiségét a tölcsérbe öntjük Bekapcsoljuk a vákuumot A szűrés befejeztével a membránt a táptalajra helyezzük, úgy, hogy a mikrobák felül legyenek A szűrőlapot úgy kell táptalajra tenni, hogy ne maradjon alatta légbuborék

Folyadék tenyésztés Alkalmazása: Kis mikrobaszám meghatározására Speciális mikrobák kimutatására, vagy dúsítására Speciális mikrobák számának meghatározására abban az esetben, ha nincs megfelelően szelektív szilárd táptalaj Általában egyes mikrobák, vagy mikrobacsoportok meghatározására használjuk, sokszor úgy, hogy a nem kívánt mikrobák szaporodását szelektíven gátoljuk Egyértelműen meg kell határozni, hogy mit tekintünk pozitív reakciónak (pl. zavarosodás, gázképződés, színváltozás, stb.) Csak pozitív vagy negatív eredmény lehetséges, a legvalószínűbb mikrobaszám (MPN) meghatározásához statisztikai módszereket (táblázatok) kell alkalmazni.

Hígítási sor készítése 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 90 ml +10 g 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml A hígítás száma: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Hígítási fok (d): 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Beoltás Minden hígításból 3 csőbe oltunk A mintát úgy kell hígítani, hogy az utolsó hígítás(ok), negatív(ak) legyen(ek)

Beoltás 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 90 ml +10 g A hígítás száma: 1. 2. 3 4. 5. Hígítási fok (d): 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Inkubálás Általában a beoltást (megszilárdulást, adszorpciót) követően azonnal megkezdjük az előírt hőmérsékleten (a megengedetett eltérés ±1 °C) Az inkubálási idő letelte után azonnal megvizsgáljuk (értékeljük) a lemezeket