Polimeráz láncreakció

Slides:



Advertisements
Hasonló előadás
Utazás a sejtben Egy átlagos emberi sejt magja megközelítőleg 510-15 gramm mennyiségű és 1,8-2 méter hosszúságú (3000 millió bázispárnyi) DNS-ből,
Advertisements

„az emberek hazudnak, de a bizonyítékok nem”
KŐVIRÁG 6.
“Valós idejű” polimeráz láncreakció (RT-PCR)
Készítette: Bacher József
Mutációk.
A polimeráz láncreakció Gurbi Bianka március 4. Emelt Biotechnológiai Számítások.
DNS replikáció Szükséges funkciók Iniciáció
Az enzimek A kémiai reakciók mindig a szabadenergia csökkenés irányába mennek végbe. Miért nem alakul át minden anyag a számára legalacsonyabb energiájú,
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor.
Oligonukleotid szintézis
A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
Az intergénikus régiók és a genom architektúrájának kapcsolata Craig E Nelson, Bradley M Hersh és Sean B Carrol (Genome Biology 2004, 5:R25) Bihari Péter.
KOMETABOLIZMUS. A fogalom tisztázása Régóta ismert tény, hogy a mikroorganizmusok képesek átalakítani szerves vegyületeket, de a termék felhalmozódik.
Real-Time PCR gyakorlati alkalmazások bevezetés Párosítsuk a gélfotóra felvitt mintákat a megfelelő olvadáspontú termékekkel!
Strukturális genomika Gyakorlati feladatok. SNP-k és vizsgálatuk Mi az SNP?
Molekuláris genetika Falus András.
Kedvenc Természettudósom:
génszabályozás eukariótákban
Polimeráz láncreakció (PCR)
Fluorescens in situ Hibridizáció
MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI
Buccalis kenet a connexin-26 gén 35delG mutációjának non-invazív szűrésére kisgyermekeken Torkos Attila 1,2, Magnus Teschner 2, Peter Erfurt 2, Gerrit.
MIÉRT NEM MÉRHETŐ? E + S P + E mol/dm3!!!!
Plazmidok Készítette: Vásárhelyi Miklós. : E. Coli jól használható genetikai kísérletekben: Genomja kicsi(4,2*10 6 bázispár, kb. ezrede az emberének)
Készítette: Leidecker Orsolya
2009. november 26. Transzgének expressziós profiljának felvétele Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények.
Géntechnikák Labor FÁG DISPLAY
DNS amplifikáció pl . DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van
DNS chipek, DNS hibridizáció
FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ
Nukleotid típusú vegyületek
A gélelektroforézis Alkalmazása: különböző molekulák (nukleinsavak, fehérjék) -méret szerinti elválasztását, -detektálását -mennyiségének meghatározását.
NUKLEINSAVAK MBI®.
Génsebészet Cseh Zsófia.
ELŐNYÖK ÉS LIMITÁCIÓK MOLEKULÁRIS MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ALKALMAZHATÓSÁGA A BIOREMEDIÁCIÓBAN Balázs Margit.
FDA hidrolízis aktivitási teszt
ATP (Adenozin-trifoszfát) meghatározása talajban - kénsavas, foszfátos extrakciós eljárással Tóth Anna Szilvia.
Matematika feladatlap a 8. évfolyamosok számára
1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA
IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László.
A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása
A P elem technikák: enhanszerek és gének csapdázása
A foszfát csoport az S, T és Y oldalláncok hidroxil- csoportjához kapcsolódik.
Készítette: Czigléczki Gábor
Gyakorlati képzés: Genetikai variációk igazolása PCR segítségével.
DNA-Fingerprint1 Polimeráz-láncreakció termékeinek vizsgálata agaróz gélelektroforézissel.
Receptor és szenzor fehérjék számítógépes tervezése Összeállította: Kiss Lóránd 2009.április.24. Bioinformatika szakirodalmi tanulmányok.
MSc 2012 ENZIMES ÖSSZEFOGLALÓ Egy egység az az enzim mennyiség, amely 1  mol szubsztrátot alakít át vagy 1  mol terméket képez 1 perc alatt adott reakció.
DNS szintézis, replikáció Információ hordozó szerep bizonyítéka Avery-Grifith kísérlet Bakterifágos kísérlet.
Primer tervezés qPCR-hez
Új molekuláris biológiai módszerek
Polimeráz Láncreakció:PCR, DNS ujjlenyomat
Replikáció Wunderlich Lívius 2015.
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
Molekuláris biológiai módszerek
A nukleinsavak szerkezete
Új molekuláris biológiai módszerek
Proteomika, avagy a fehérjék „játéka”
Molekuláris biológiai módszerek
Új molekuláris biológiai módszerek
Molekuláris biológiai módszerek
Győri Edit Lelle Kocsis Kinga
A DNS replikációja Makó Katalin.
Készítette:Tóth Karolina
Új molekuláris biológiai módszerek
ASPERGILLUS FLAVUS ÉS FUSARIUM SPP. ELŐFORDULÁSA HAZAI KERESKEDELMI FORGALOMBAN KAPHATÓ FŰSZERPAPRIKA MINTÁKBAN Készítette: Lehotkai Péter
EPIGENETIKA OLYAN JELENSÉGEKKEL FOGLALKOZIK, AMELYEK KÖVETKEZTÉBEN
Előadás másolata:

Polimeráz láncreakció Készítette: Feigl Viktória

PCR (polymerase chain reaction) A speciális, kiválasztott DNS szekvencia amplifikációja enzimes reakciók ismétlődésével in vitro körülmények között. Szelektív módszer, előnye a hagyományos technikákkal szemben, hogy speciális DNS fragment vizsgálatát teszi lehetővé. Minden egyes PCR ciklusban a DNS mennyisége a reakcióelegyben megduplázódik, azaz 30 ciklus után 109-szerese a kezdeti DNS mennyiségnek. A reakció végterméke gélelektroforézissel vizsgálható.

PCR története Kary B.Mullis (Cetus) fedezte fel 1983-ban 1985-ben jelent meg a cikk 1993-ban kémiai Nobel-díj Ötlet: olyan eljárást kellene kifejleszteni, amely a DNS-t mesterségesen megsokszorozza a DNS-polimeráz enzim segítségével, megismételt duplikációs ciklusok által.

A DNS polimeráz enzim: Az eredeti eljárás: Megtalálható az élő szervezetekben Funkciója a DNS lemásolása a sejt osztódásakor A DNS egyik szálához kötődve létrehozza a komplementer szálat. Az eredeti eljárás: A kettős szálú DNS két szálra választása 96°C-ra történő hevítéssel

96°C-on a DNS polimeráz lebomlott enzimet minden ciklusban pótolni kellett Kevéssé hatékony Időigényes Nagy DNS-polimeráz fogyasztás Folyamatos figyelem Megoldás: Thermus aquaticus Yellowstone Parkban izolálták (1969) Thomas Brock és Hudson Brock fedezte fel

Magas hőmérsékleten stabilis DNS-polimeráz – nem bomlik le a hevítési lépésben, nem szükséges minden ciklusban újat hozzáadni Eljárás leegyszerűsödése Automatizálhatóság

Taq polimeráz 1976-ban izolálták a T. aquatcus-ból Hőmésékleti optimuma 80°C Hátránya: hibázik, mutációk Nem rendelkezik 3’→5’ hibajavító exonukleáz aktivitással Helyette: Archea Pfu, Pwo, de lassabbak Megoldás: Taq és Pfu kombinációja (gyors és pontos)

Mire van szükség a PCR reakcióhoz? DNS-templát vagy cDNS– ez tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját Két primer – amely meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét DNS-polimeráz – amely lemásolja az amplifikálandó szakaszt Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t Puffer – amely biztosítja a DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet

A primerek Segítségükkel határozható meg az amplifikálandó DNS szakasz Komplementerek az amplifikálandó DNS szakasz elejével és végével Rövid, mesterséges DNS szálak Hosszuk: 17-30 bp Nem tartalmaznak komplementer régiót (egymással nem képeznek primer-dimert)

Primertervezés Optimális olvadási hőmérséklet: 60-75 °C Olvadási hőmérséklet: Ahol a primer kötőhelyeinek fele foglalt Nő a primer hosszával Túl magas (80°C felett): DNS polimeráz kevéssé aktív – limitált hossz Legtöbb primer G+C tartalma >50% → magasabb olvadáspont Két primer egyező olvadási T → nem specifikus termékek elkerülése és mindkét primer felől azonos amplifikáció Rövid primerek: több helyre kapcsolódhatnának →nem specifikus kópiák Optimális hossz: 20-40 nukleotid Specifikus gén vagy egy adott mikroorganizmus faj detektálásához – A keresett DNS-re specifikus primer, amely kizárólag a target szekvenciához kapcsolódik Mikroorganizmus csoport detektálásához – DNS konzervált régiójára tervezni

Degenerált primerek Hasonló, de nem azonos primerek keverékei Ha ugyanazt a gént különböző organizmusokból kell amplifikálni (hasonló, de nem azonos gének) Ha a tervezésnél a fehérjeszekvenciát veszik figyelembe (egy aminosav több kódon) Csökkentik a PCR amplifikálás specifitását Problémát részben megoldja a Touchdown PCR

PCR eljárás 1. Denaturáció (94-96°C, 1-2 perc) A két DNS szálat összekötő H-hidak felbomlanak (1. ciklus előtt hosszabb denaturálás a teljes szeparációhoz) 2. Primertapadás / annealing (55-60°C, 1-2 perc) A primerek hozzákapcsolódnak a DNS szálakhoz Hőm. ált. 5°C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt 3. Lánchosszabbítás (72°C, 1-2 perc) A DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat T és t függ a DNS-polimeráztól, t az amplifikálandó szakasz hosszától (ált. 1000 bp/perc) Utolsó ciklus után hosszabb lánchosszabbítás

A PCR-ciklus sematikus ábrája. Denaturálás Primertapadás Meghosszabbítás (P=polimeráz). Az első ciklus véget ért. Az eredményül kapott két DNS-szál a következő ciklus templátja lesz, azaz minden ciklusban megkétszereződik a DNS mennyisége.

Detektálás - Gélelektroforézis A PCR-termék összehasonlítva a DNS-létrával agargélen. A DNS-létra (1. sáv), a PCR-termék alacsony koncentrációban (2. sáv) és magas koncentrációban (3. sáv) Helmut W. Klein, Biokémiai Intézet, Kölni Egyetem, Németország

Nested PCR Nem specifikus primerkötések, azaz nem kívánt termékek (szennyeződés) kiküszöbölésére. Két sorozat primer két egymást követő PCR reakcióban. A második primerpár (nested primer) az első reakció termékén belül köt („fészkel”). Elv: Ha az első primer rossz helyre köt, nagyon kicsi az esélye, hogy a másodiknak is legyen nem kívánt kötőhelye, azaz ezután is legyen nem kívánt termék.

Touchdown PCR A specifitás növelésére Elv: a primertapadás hőmérséklete meghatározza annak specifitását – alacsonyabb hőmérsékleten a primer kevésbé specifikusan köt A kezdeti hőmérséklet a primerek olvadási jóval hőmérséklete (Tm) fölött van A hőmérsékletet ciklusonként 1-2 °C-kal csökkentik; a primer a lehető legmagasabb, még elviselhető hőmérsékleten fog tapadni, itt a legnagyobb a specifitás Később ezek a fragmensek amplifikálódnak tovább, elnyomva a nem specifikus termékeket A hőmérséklet fokozatosan csökken a primer Tm-hez (touchdown hőmérséklet, ideális), utána itt folytatódik a primertapadás további 10 vagy több cikluson át

Inverz PCR Ha a target szakaszon belül ismert egy szekvencia – a két szélén nem Emésztés (kis szakaszokra)→ önligálás (cirkuláris forma) → hasítás restrikckiós enzimmel az ismert szekvencián belül → ismert két szélső szekvencia → PCR Szélen elhelyezkedő transzpozonok és genomikus inzerciók identifikálására

Reverz Transzkripció PCR (RT-PCR) RNS amplifikációjára Alkalmazások: Kis mennyiségben jelen lévő RNS-ek detektálása cDNS könyvtárak létrehozása Reverz transzkripció „primerje”: oligo dT, ami az RNS 3’ végének poliA szekvenciájához köt (helyette lehet random hexamer vagy specifikus primerek) RT: 37 °C, 1 óra; RNS lebontása RNázH-val; cDNS komplementer szálának szintetizálása magasabb T-n

Real-Time PCR Video Kvantitatív módszer! Minden PCR ciklus után megadja a DNS mennyiségét „real-time” * Fluoreszcens festék – a kettős szálú DNS-hez köt * DNS oligonukleotid próba – a kiegészítő szálhoz kötve fluoreszkál Gyakran a Reverz Transzkripció PCR-ral együtt használják kis mennyiségű RNS (mRNS) mennyiségének meghatározására – a gén expresszió szintjének mérése Hagyományos módszer: Northern blotting, hátránya, hogy csak nagy mennyiségű RNS esetén működik

Fluoreszcens festék SYBR Green - Kétszálú DNS-hez köt (egyszálúhoz és primerhez nem) miután a DNS-polimeráz megszintetizálta a 2. szálat, fluoreszkál → detektorral mérhető Standard hígítási sorhoz hasonlítva mérhető a mennyiség Relatív mennyiséget ad meg Hátrány: Nem sepcifikus PCR termékekhez is köt, Előny: Relatíve olcsó Cianid festék Kék fénnyel indukálható (λmax = 488 nm) zöld fényt bocsát ki (λmax = 522 nm) Mutagén etídium-bromid helyett használható Egyéb festékek: SYBR Gold, YO (Oxazole Yellow), TO (Thiazole Orange), PG (PicoGreen)

Fluoreszcens oligonukleotid próba – FRET módszer Fluorescence (or Förster) Resonance Energy Transfer Két fluorofór: Zöld (rövid λ): reporter dye („jelző”), 5’ végen, (gyakran GFP) Piros (hosszú λ) : quenching dye („elnyomó”), 3’ végen Az piros fluorofór elnyeli a zöld által kibocsátott fényt FRET által A próba hozzáköt a DNS-hez, majd a polimeráz működése közben eltávolítja. Így a zöld fluorofór eltávolodik a pirostól és a kibocsátott fény mérhető. Előnye: specifikus! Egyszerre több szekvencia is detektálható többféle színű festék használatával.

TaqMan Molecular Beacon Különbség: A molecular beacon intakt marad, minden ciklusban újra tud kötni. Denaturáció során a hajtű szerkezet felbomlik, köt a DNS-hez és fényt emittál, mivel a zöld fluorofór eltávolodik a pirostól. (Ami nem köt az visszanyeri a hajtű szerkezetet és inaktív.)

Mennyiségi meghatározás Minél nagyobb a kezdeti target DNS mennyisége, annál hamarabb észlelhető szignifikáns növekedés a fénykibocsátásban. A fix küszöbértéket egy adott ciklusban éri el a fluoreszcencia (CT = cycle treshold), amit logaritmikus diagramon ábrázolva standard hígítási sorhoz viszonyítva meghatározható a kezdeti DNS mennyisége (relatív – minták egymáshoz hasonlítása) Felhasználás: A gén transzkripció érzékeny mennyiségi meghatározására. Diagnosztika: fertőző betegségek, rák, genetikai rendellenességekben szerepet játszó gének gyors detektálására. Génexpresszió változásának nyomon követése: Szövet vagy sejtkultúrák reakciója gyógyszerekre, környezeti körülmények változására – indukált mutációk (környezeti mikrobiológia – rezisztens gének detektálása).

A PCR alkalmazásai Genetikai ujjlenyomat - személyek azonosítása Örökletes betegségek kimutatása Fertőző betegségek kimutatása – fertőzést okozó mikroorganizmus DNS-ének amplifikálása (immunválasz elmaradása vagy álpozitív eredmény esetén is) Ősi DNS elemzése pl. mamut, egyiptomi múmiák Rokonság vizsgálat pl. apasági perek, evolúciókutatás Génklónozás